组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
固定化大鼠酚磺基转移酶（rat PST）的表观动力学参数（K*m、V*max）；样品基质：100 mM Bicine 缓冲液（pH 7.0，含 PAP 与 pNPS）
检测原理
PST 通过 APTES/sulfo-SMCC 固定于 SiO2 平面，形成单侧催化表面。反应液含底物 PAP 和 pNPS，在石英微流道中按设定流速流动，停留时间 τ 决定底物在催化表面附近的暴露时间。PST 催化磺基转移生成 pNP，pNP 在中性或碱性条件下于 400 nm 有强吸收，UV-vis 吸光度正比于产物生成量，从而反映表面反应速率。模型将平推流反应器、z 方向扩散与表面 Michaelis-Menten 反应耦合；当 Damköhler 数 Da<1 时，扩散快于表面反应，z 方向浓度近似均匀，可退化为表面反应限制方程。通过改变 [S]o 和 τ 测量出口转化率 Rτ，回归得到 K*m 与 V*max；高底物饱和条件下用简化式直接求 V*max/H，低底物条件下回归 K*m。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
实验验证了模型在微流控平面反应器中的适用性：不同底物浓度和酶失活阶段下 Da 均低于 0.1，满足表面反应限制条件。三组固定化 PST 失活曲线一致，活性损失可预测，并用于归一化 V*max/H。AFM 估计单位面积 PST 约 0.38 pmol/dm2，初始 V*max/H 为 2.16 μM/min，对应 V*max 约 27.2 nmol/min/mg；游离 PST 的 Km 为 4.10 ± 0.26 μM、Vmax 为 295 ± 3 nmol/min/mg。固定化 PST 的 K*m(PAP) 为 17.87 ± 0.39 μM，高于游离酶，V*max 约为游离酶的 1/10，作者归因于固定化后构象、取向、自由度及微环境变化。该方法为标准化比较固定化酶性能、开发酶联生物传感器和微流控生物反应器提供平台。
传感器的构成
- 基底/反应器下板：P型 Si(100) 晶圆，表面生长 100 nm SiO2，置于玻璃支撑板上，提供平面催化表面与机械支撑
- 表面修饰层：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）硅烷化形成氨基表面，再偶联 sulfo-SMCC 马来酰亚胺连接子，用于通过巯基固定酶
- 催化/识别元件：大鼠酚磺基转移酶（rat PST，EC 2.8.2.1），固定于 SiO2 表面，催化 PAP 与 pNPS 的磺基转移反应
- 信号标记物：对硝基苯酚（pNP），PST 催化产物，在 400 nm 有强吸收，作为报告分子
- 封闭剂：50 mM 2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol），封闭未反应的马来酰亚胺位点
- 流道/上板：石英顶板刻蚀曲折流道，形成 72.6 cm × 0.194 cm × 167 μm 通道，控制停留时间 τ
- 信号读出：UV-vis 分光光度计检测 400 nm 处 pNP 吸光度，用于计算底物转化率 Rτ
中文摘要
原位分析固定化酶是将酶嵌入标准集成电路和微机电系统平面技术、构建生物反应器或酶联生物传感器的关键步骤。本文基于质量传递动力学和 Michaelis-Menten 方程，发展了一种表面反应限制模型，用于系统、标准化地测定平面表面上固定化酶的表观 Michaelis-Menten 常数 K*m 和单位催化表面积最大反应速率 V*max。该模型方程经计算机模拟和实验验证。作者构建了具有单侧平面催化表面的微流控生物反应器，其通道高度小于半无限扩散过程中的扩散层厚度，从而满足表面反应限制条件。利用该平台，成功原位测定了固定化于二氧化硅表面的大鼠酚磺基转移酶（PST）的 K*m 和 V*max，并讨论了固定化酶与游离酶之间动力学常数变化及性能差异的可能原因。
英文摘要
Analysis of immobilized enzyme in situ is a crucial step to embed an enzyme onto the planar technology of standard integrated circuit (IC) and microelectromechanical systems (MEMS) for a bioreactor or enzyme-coupled biosensor. A surface reaction limited model, based on a systematized and standardized approach, mathematically derived from mass transfer dynamics and the Michaelis-Menten equation for the measuring the apparent K*(m) (Michaelis-Menten constant) and V*(max) (maximum reaction rate per unit surface area of catalyst) of an immobilized enzyme on a planar surface was developed. The derived equations for the kinetic model were simulated and experimentally confirmed. A platform of a microflow bioreactor with a one-sided planar catalytic surface that contained immobilized enzyme was constructed. The microfluidic bioreactor was designed to possess a channel height less than that of the diffusion layer thickness in a semi-infinite diffusion process, and K*(m) and V*(max) of rat phenol sulfotransferase (PST) immobilized on the silicon oxide surface were successfully determined in situ. Variation in kinetic constants and the possible differences in performance between free and immobilized PST are discussed.