组成图示
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传感器类型
微流控生物传感器
检测对象
单核细胞增生李斯特菌 Listeria monocytogenes（L. monocytogenes）；样品基质为细菌培养物/食品相关样品（含其他李斯特菌及常见食源性细菌背景）
检测原理
该芯片以 SiO2 表面固定的生物素化 Hsp60 作为识别元件，L. monocytogenes 表面表达的 LAP 与 Hsp60 发生特异性结合（KD≈1.68×10^-8 M），使目标菌被捕获在识别层上；捕获菌量随样品中目标菌浓度增加而增加。DEP 模块通过 Ti/Au 叉指电极施加 10 Vp-p、1 kHz 非均匀交流电场，产生介电力将细菌聚集到电极边缘及识别表面，增强菌体与 Hsp60 的接触概率，从而放大捕获信号。捕获后的细菌用 PI 或 acridine orange 荧光染色，荧光显微镜下计数，计数值与捕获量成正比，实现目标菌的定性/半定量检测。
检测灵敏度
捕获限: about 5 × 10^5 cells/well
效应效果
Hsp60 芯片对 L. monocytogenes 的净捕获量为 2.0±0.5×10^5 个/芯片，L. ivanovii 为 1.4±1.1×10^5 个/芯片，其他李斯特菌仅 10^3–10^4 个/芯片；LAP 缺失突变株 KB208 结合显著降低。与沙门氏菌、大肠杆菌 O157:H7、假单胞菌等混合时，GFP 标记目标菌捕获率为 58–77%，仅金黄色葡萄球菌无显著差异。微流控芯片中 Hsp60 捕获率为 58.6%，mAb-C11E9 为 16.6%，B-BSA 对照为 5.6%。DEP 5 min 使捕获提高 60%，30 min 和 60 min 分别提高约 3 倍和 8 倍。作者认为 Hsp60 可替代抗体降低假阳性，并可通过重组表达降低成本。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：硅基底上热生长 SiO2 层（3500±200 Å），DEP 芯片另沉积 50 nm Ti/250 nm Au 叉指电极，用于承载识别层并施加非均匀交流电场
- 微流控样品腔：PDMS 微流控通道或孔（25 µm 高、250 µm 宽；或 23.04 mm² 孔），用于容纳样品、孵育和洗涤
- 封闭/连接层：生物素化 BSA（B-BSA）吸附于 SiO2 表面，提供生物素位点并减少非特异结合
- 亲和固定层：链霉亲和素（streptavidin）结合 B-BSA，用于定向固定生物素化识别蛋白
- 识别元件：生物素化 Hsp60（B-Hsp60）或对照生物素化 mAb-C11E9，特异性结合 L. monocytogenes 表面 LAP 或 NAM
- 信号标记/读出：碘化丙啶（PI）或荧光素（acridine orange）染色捕获菌，经荧光显微镜计数；DEP 功能发生器施加 10 Vp-p、1 kHz 交流电场增强捕获
中文摘要
高效捕获目标分析物是生物传感器平台可靠、特异检测病原微生物的前提。抗体虽广泛用作识别配体，但存在结合不稳定、表面固定后活性下降及结合位点有限等问题，因此需要替代受体。热休克蛋白60（Hsp60）是真核线粒体伴侣蛋白，在单核细胞增生李斯特菌感染过程中作为李斯特菌黏附蛋白（LAP）的宿主受体。本文报道将生物素化 Hsp60 作为捕获分子，用于微流控环境中活 Listeria monocytogenes 的捕获。Hsp60 固定于链霉亲和素修饰的二氧化硅表面，可在其他李斯特菌种及沙门氏菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、假单胞菌、沙雷氏菌、哈夫尼亚菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌和乳杆菌等背景菌存在下特异捕获致病性李斯特菌。与单克隆抗体 mAb-C11E9 相比，Hsp60 对 L. monocytogenes 的捕获效率提高83倍；在最终1 h孵育开始时施加5 min介电电泳（DEP）力，捕获率再提高60%。结果表明 Hsp60 可作为生物芯片传感平台特异检测 L. monocytogenes 的新型识别元件。
英文摘要
Efficient capture of target analyte on biosensor platforms is a prerequisite for reliable and specific detection of pathogenic microorganisms in a microfluidic chip. Antibodies have been widely used as ligands; however, because of their occasional unsatisfactory performance, a search for alternative receptors is underway. Heat shock protein 60 (Hsp60), a eukaryotic mitochondrial chaperon protein is a receptor for Listeria adhesion protein (LAP) during Listeria monocytogenes infection. This paper reports application of biotinylated Hsp60 as a capture molecule for living (viable) L. monocytogenes in a microfluidic environment. Hsp60, immobilized on the surface of streptavidin-coated silicon dioxide exhibited specific capture of pathogenic Listeria against a background of other Listeria species, Salmonella, Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Hafnia, Enterobacter, Citrobacter, and Lactobacillus. The capture efficiency of L. monocytogenes was 83 times greater than another Listeria receptor, the monoclonal antibody, mAb-C11E9. Additionally, the capture rate was further increased on a Hsp60-coated biochip by 60% when a dielectrophoresis force was applied for 5 min at the beginning of the final 1 h incubation step. Our data show that Hsp60 could be used for specific detection of L. monocytogenes on a biochip sensor platform.