组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
其他（19F NMR生物传感器）
检测对象
碳酸酐酶（CA）抑制剂/配体：乙氧唑胺（ethoxzolamide, EZA）、4-磺酰胺苯甲酸（4-sulfamoylbenzoic acid, SBA）、苯磺酰胺（benzenesulfonamide, BS）；样品基质：人红细胞悬液/细胞内环境（in-cell RBCs），体外纯化Fb-CAI对照
检测原理
SA-Fb中的苯磺酰胺配体先与内源CA活性位点高亲和结合，使苯磺酸酯邻近CA表面亲核His67，发生SN2反应，共价安装19F探针Fb并释放配体，因此活性位点仍可用于配体结合。当CA抑制剂/配体（EZA、SBA、BS）进入细胞并结合CA时，Fb局部电子环境改变，19F NMR信号从-62.0 ppm移至-62.5 ppm；峰面积比随抑制剂浓度变化，实现细胞内定量检测。19F无天然背景，信噪比高；细胞通透性会影响响应，如阴离子SBA响应低于中性BS。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2。
效应效果
LDT试剂在37℃水溶液中48 h仅约10%水解；对纯化CAII 48 h标记率约75%，EZA或无配体对照均不标记，10 mM GSH不降低标记率，并在五蛋白混合物中仅标记CAII。标记位点为His3/His67，去除小分子后CAII催化活性与天然蛋白一致。红细胞内48 h无溶血，仅出现eCA荧光条带，EZA可阻断；小鼠静脉注射SA-Bt后4 h即可检测到eCA生物素化，无不良生理效应。19F NMR传感器无背景，可实时监测EZA等CA配体结合；非配体TA无响应，细胞内SBA响应低于BS，反映细胞通透性差异。
传感器的构成
- 细胞/内源蛋白基底：人红细胞（RBCs）及内源碳酸酐酶I（eCAI/CAI），提供识别与换能蛋白环境
- 配体导向标记层：SA-Fb（含苯磺酰胺配体SA和19F探针Fb的LDT试剂），结合CA活性位点并邻近标记His67
- 19F信号标记物：双(三氟甲基)苯衍生物（Fb），作为19F NMR报告基团，配体结合后化学位移改变
- 被测物/识别对象：碳酸酐酶抑制剂/配体（EZA、SBA、BS），与eCAI活性位点结合
- 检测介质：HEPES缓冲盐水含20% D2O和167 mM三氟乙酸（TFA，内标，-75.6 ppm），用于19F NMR测量
- 信号读出：19F NMR峰位移与峰面积比（未结合-62.0 ppm，结合-62.5 ppm），实现细胞内定量检测
中文摘要
本文报道了配体导向甲苯磺酰（LDT）化学方法，用于在活体条件下将合成分子位点选择性地连接到特定内源蛋白。该方法利用蛋白配体与靶蛋白高亲和结合，通过邻近效应驱动亲电苯磺酸酯与蛋白表面亲核氨基酸发生SN2反应，在标记探针的同时释放配体，避免活性位点被永久占据。作者以碳酸酐酶（CA）为模型，合成含苯磺酰胺配体和荧光、生物素或19F NMR探针的LDT试剂，在纯化蛋白、红细胞、组织和小鼠中实现CA选择性标记，并证明标记后蛋白保留催化活性。进一步将19F探针安装到红细胞内源CA，构建无需基因工程的细胞内19F NMR生物传感器，可实时监测CA抑制剂/配体结合引起的化学位移变化。该工作确立LDT化学作为研究和操控生物系统的新工具。
英文摘要
Here we describe a method for the site-selective attachment of synthetic molecules into specific 'endogenous' proteins in vivo using ligand-directed tosyl (LDT) chemistry. This approach was applied not only for chemically labeling proteins in living cells, tissues and mice but also for constructing a biosensor directly inside cells without genetic engineering. These data establish LDT chemistry as a new tool for the study and manipulation of biological systems.