组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
PML/RARA融合基因（PML/RARA fusion gene，急性早幼粒细胞白血病APL相关DNA序列）；样品基质：磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0，含50 mM NaCl）中的合成寡核苷酸目标DNA（S2）
检测原理
玻碳电极表面经循环伏安法沉积聚咔啉羧酸（poly-CCA）膜，其末端羧基在EDC/NHS作用下活化，与5′端氨基修饰的18-mer ssDNA捕获探针（S1）形成酰胺键共价固定。目标DNA（S2）与探针杂交后形成双链DNA（dsDNA）。亚甲基蓝（MB）作为电活性嵌入剂，优先与单链DNA暴露的鸟嘌呤结合；杂交形成双螺旋后，空间位阻及高离子强度下嵌入减少，使电极表面可参与电子转移的MB量下降。差分脉冲伏安法（DPV）记录MB氧化峰电流，峰电流随目标DNA浓度增加而降低，从而实现对PML/RARA融合基因序列的电化学检测。
检测灵敏度
LOD: 6.7 × 10−13 M；线性范围: 1.0 × 10−12–1.0 × 10−11 M；回归方程: log Ip (μA) = 0.068C (pM) + 0.555；r = 0.9963
效应效果
该传感器对互补目标DNA（S2）产生显著MB峰电流下降，而非互补序列（S3）响应接近空白，单碱基错配序列（S4）响应也接近空白，表明对单碱基错配和互补序列具有良好选择性。EIS显示poly-CCA膜覆盖率约99.3%，探针固定后电荷转移电阻增加。对1.0×10−12 M目标DNA的重现性RSD为7.32%（n=8），电极经95 ℃变性后可重复使用5个杂交/再生循环。与作者实验室已建立的同类方法相比，共价固定法检出限更低、灵敏度更高。作者认为该方法有望用于APL PML/RARA融合基因实际样品检测、早期诊断和预后监测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：玻碳电极（GCE），经1.0、0.3、0.05 μm氧化铝抛光，作为工作电极与电子转导基底
- 聚合物修饰层：聚咔啉羧酸（poly-CCA）膜，循环伏安电聚合沉积，提供羧基（-COOH）与磺酸基（-SO3−）负电荷界面
- 交联活化层：EDC/NHS活化体系，活化poly-CCA末端羧基形成活性酯，用于与DNA氨基共价连接
- 识别元件：18-mer ssDNA捕获探针（S1，5′-NH2-TCT CAA TGG CTG CCT CCC-3′），5′端氨基共价固定，特异性识别PML/RARA目标序列
- 杂交识别界面：双链DNA（dsDNA），捕获探针S1与互补目标DNA（S2）杂交形成，改变MB可及性
- 信号标记物：亚甲基蓝（MB），电活性嵌入剂/指示剂，与ssDNA鸟嘌呤结合，杂交后结合减少并产生DPV电流变化
- 清洗介质：0.1% SDS磷酸盐缓冲液（pH 7.30），去除未结合探针与MB，降低非特异吸附
- 检测介质：0.1 M PBS（pH 7.00，含50 mM NaCl），用于杂交与MB积累，维持离子强度
中文摘要
本文通过循环伏安法制备聚咔啉羧酸（poly-CCA）膜修饰电极，建立用于急性早幼粒细胞白血病（APL）PML/RARA融合基因检测的电化学DNA生物传感器。以18碱基单链DNA为捕获探针，利用EDC和NHS交联反应，将探针5′端氨基共价连接于羧基端聚CCA修饰玻碳电极（GCE）表面，形成明确的识别界面。捕获探针可与目标DNA选择性杂交，在电极表面形成双链DNA（dsDNA）。采用差分脉冲伏安法（DPV）监测杂交反应，以亚甲基蓝（MB）为电活性指示剂；杂交后MB氧化峰电流下降。在pH 7.0磷酸盐缓冲液（PBS）中，氧化峰电流与互补链浓度在1.0×10−12至1.0×10−11 M范围内线性，检出限为6.7×10−13 M。该方法对单碱基错配序列和互补序列杂交后具有良好特异性，有望用于实际样品检测。
英文摘要
In this article, the poly-calcon carboxylic acid (poly-CCA) film modified electrode was prepared by cyclic voltammetry (CV). Then, an electrochemical DNA biosensor was developed for detection of PML/RARA fusion gene in acute promyelocytic leukemia (APL) by using 18-mer single-stranded deoxyribonucleic acid as the capture probe. The capture probe was covalently attached through free amines on the DNA bases using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydrosulfosuccinimide (NHS) cross-linking reaction on a carboxylate-terminated poly-CCA monolayer modified glassy carbon electrode (GCE). The covalent immobilized capture probe could selectively hybridize with its target DNA to form double-stranded DNA (dsDNA) on GCE surface. The aim of this work is to provide a well-defined recognition interface for the detection of DNA. Differential pulse voltammetry (DPV) was used to monitor the hybridization reaction on the capture probe electrode. The decrease of the peak current of methylene blue (MB), an electroactive indicator, was observed upon hybridization of the probe with the target DNA. The results indicated that in pH 7.0 phosphate buffer solution (PBS), the oxidation peak current was linear with the concentration of complementary strand in the range of 1.0 x 10(-12) to 1.0 x 10(-11)M with a detection limit of 6.7 x 10(-13)M. This new method demonstrates its excellent specificity for single-base mismatch and complementary sequence (dsDNA) after hybridization, and it would be proposed to use in real sample.