组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
转基因玉米 CBH 351（StarLink）目标 DNA（cry9c/35S 相关序列）、玉米内源淀粉合成酶 ssIIb 基因；样品基质为玉米种子 DNA 提取物、真实玉米样品及合成质粒 DNA
检测原理
LAMP 四引物识别 CBH 351 目标 DNA 的六个区域，Bst DNA 聚合酶在 65 °C 下进行等温链置换扩增，生成大量茎环/花椰菜状双链 DNA 产物。未纯化产物与 PBS 和 H33258 混合后，H33258 作为氧化还原活性小沟结合分子进入双链 DNA 的 AT 富集小沟，形成 DNA-H33258 复合物。该复合物向电极表面扩散变慢，使 H33258 的氧化阳极峰电流下降。目标 DNA 拷贝数越高，LAMP 产物越多，被结合的 H33258 越多，峰电流越低；无模板时自由 H33258 氧化峰电流最高。DEP 芯片碳工作电极通过 LSV 记录阳极峰电流变化，实现无需探针固定的电化学检测。
检测灵敏度
LOD: 3 × 10^2 copies/reaction
效应效果
该传感器在 65 °C LAMP 反应 20 min 即可检出 CBH 351 扩增产物，40 min 后信号趋于饱和，60 min 仍稳定；可检测 0.1% 和 0.05% 真实玉米样品中的 CBH 351，并用淀粉合成酶 ssIIb 基因确认玉米内源特征。阴性对照无模板时不产生扩增，H33258 氧化峰电流最高，表明无假阳性。作者使用 CaM03-50/CBH02-30 与 Cry9c-50/35Ster-30 两组引物分别进行初筛和验证，提高特异性；电化学结果与凝胶电泳一致。与 PCR 相比，LAMP 在等温条件下效率更高，且无需 DNA 纯化和探针固定，扩增与检测在同一一次性 DNA 棒中完成，降低交叉污染风险。作者认为该低成本、快速系统可用于转基因食品和环境样品监测。
传感器的构成
- 换能器电极：一次性电化学印刷芯片(DEP)三电极系统，含碳基工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳基对电极，用于LSV电流读出
- 微流控载体：聚丙烯DNA棒(DS)，含扩增层、检测层和混合阀，实现LAMP扩增与电化学检测一体化
- 识别元件：LAMP引物组(FIP、BIP、F3、B3)与Bst DNA聚合酶，特异性识别CBH 351目标DNA并催化等温链置换扩增
- 信号标记物：Hoechst 33258(H33258)，氧化还原活性DNA小沟结合分子，与LAMP双链产物结合后降低氧化峰电流
- 反应介质：PBS缓冲液(20 mM, pH 7.4)和矿物油，用于稀释/混合LAMP产物并防止蒸发
- 读出装置：Autolab PGSTAT 12电化学工作站，以线性扫描伏安法(LSV)记录阳极峰电流变化
中文摘要
本研究首次报道一种高效、准确且低成本的快速检测系统，将等温扩增与未纯化扩增产物的电化学分析集成。实验中，环介导等温扩增（LAMP）在 65 °C 恒定温度下进行，其扩增效率高于 PCR。扩增产物与氧化还原活性分子 Hoechst 33258（H33258，20-(4-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-双(1H-苯并咪唑)）混合，并在集成一次性电化学印刷芯片（DEP）的 DNA 棒（DS）中，通过线性扫描伏安法（LSV）进行分析。H33258 与 DNA 小沟结合后，其氧化峰电流强度显著下降；利用该 DNA 结合引起的阳极峰电流变化，可检测玉米 CBH 351 品种（StarLink）。由于无需繁琐的探针固定，且扩增与检测在同一装置中完成，该生物传感器可避免潜在交叉污染。作者认为此类传感器将对环境保护产生前所未有的影响。
英文摘要
In this study, we are reporting for the first time an efficient, accurate and inexpensive rapid detection system which employs the integration of isothermal amplification and subsequent analysis of unpurified amplicons by an electrochemical system. In our experiments, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with its higher efficiency than PCR was performed at a constant temperature (65 degrees C). Amplification products were combined with a redox active molecule Hoechst 33258 [H33258, 2'-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-bi(1H-benzimidazole)] and analyzed by a DNA stick (DS) which is integrated with a disposable electrochemical printed (DEP) chip using linear sweep voltammetry (LSV). The DNA minor groove binding of the H33258 molecule causes a significant drop in the peak current intensity of the H33258 oxidation. The phenomenon of DNA binding induced by H33258, in addition to changes in the anodic current peak, was used to detect maize CBH 351 variety (StarLink). Since laborious probe immobilization was not required, and amplification and detection were performed on a single device, our biosensor eliminates potential cross-contamination. We believe that this type of sensor will have an unprecedented impact for environmental protection.