组成图示
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传感器类型
电化学发光(ECL)生物传感器
检测对象
人凝血酶（human thrombin/α-thrombin）；样品基质为PBS+缓冲液中的标准溶液，干扰测试含溶菌酶和ATP
检测原理
该传感器以金电极为换能器，巯基修饰的适配体探针I通过Au–S键固定于电极表面。凝血酶与探针I特异性结合后，5′-生物素修饰的探针II再与凝血酶结合，形成适配体–凝血酶–适配体夹心结构；亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点经生物素–亲和素系统连接到探针II。ECL测量时，负电位扫描使电极表面QDs被还原为QD•−，同时共反应物S2O8^2−被还原为强氧化剂SO4•−；QD•−与SO4•−反应生成激发态QD*，QD*回到基态时发射300–650 nm光。ECL强度取决于结合在探针II上的QDs数量，而QDs数量与夹心结构中的凝血酶量间接正比，因此信号随凝血酶浓度升高而增强。
检测灵敏度
LOD: 2.72 nM；响应范围: 0–20 μg/mL；对数线性范围: 27.2 nM–545 nM
效应效果
该传感器对凝血酶具有良好选择性：10 μg/mL溶菌酶和ATP孵育后ECL信号与新鲜制备电极背景基本一致，而相同浓度凝血酶产生明显增强。稳定性方面，在0.1 μg/mL凝血酶存在下连续循环伏安扫描12圈，仍能保持稳定且较高的ECL信号，表明具有电位循环稳定性。灵敏度方面，最低检测浓度2.72 nM，与电化学方法（2 nM）和荧光方法（2.7 nM）相当。作者认为该方法无需标记目标蛋白，QDs具有高ECL强度、良好生物相容性和导电性，适配体–目标结合与亲和素–生物素系统使组分牢固固定，为蛋白检测提供了简便、低成本且特异的方法。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），经piranha溶液清洗，作为ECL工作电极
- 识别元件1：5′-巯基修饰15核苷酸抗凝血酶适配体探针I（probe I），通过Au–S键自组装固定并识别凝血酶
- 封闭/非特异吸附去除层：6-巯基-1-己醇（MCH，1 mM），处理2 h以去除非特异吸附DNA
- 被测物结合层：人凝血酶（human thrombin/α-thrombin），与探针I形成适配体–凝血酶亲和复合物
- 识别元件2：5′-生物素修饰29核苷酸抗凝血酶适配体探针II（probe II），与凝血酶结合形成夹心结构
- 信号标记物：亲和素修饰量子点（avidin–QDs，CdSe/ZnS核壳结构，约10 nm），通过生物素–亲和素系统结合探针II并提供ECL发光
- 封闭剂：牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL PBS+），稀释并封闭avidin–QDs活性位点
- ECL电解质/共反应物：PBS+含0.1 M K2S2O8和0.1 M KCl，提供S2O8^2-共反应物并支持电荷转移
中文摘要
本文报道了一种基于量子点（QDs）电化学发光（ECL）技术检测凝血酶的新型生物传感器。首先将巯基末端修饰的15核苷酸抗凝血酶适配体探针I固定于金电极表面，随后引入凝血酶形成适配体–凝血酶亲和复合物；接着使5′-生物素修饰的29核苷酸适配体探针II与已结合的凝血酶杂交，形成夹心型结构。亲和素修饰的量子点（avidin–QDs）通过生物素–亲和素系统结合到探针II上。QDs的ECL信号与探针II的量相关，并间接正比于结合的凝血酶量。在0–20 μg/mL范围内，ECL强度随凝血酶浓度增加而增强；在27.2–545 nM范围内与凝血酶浓度对数呈线性关系，最低检测浓度为2.72 nM。该传感器对凝血酶表现出良好的选择性和稳定性。
英文摘要
A novel biosensor for the detection of thrombin was developed by using QDs electrochemiluminescence (ECL) technique. The thiol-terminated aptamer with 15 nucleotides (probe I) was first immobilized on Au electrode, and then thrombin was imported to form the aptamer-thrombin bioaffinity complexes. Another 5'-biotin modified aptamer (29 nucleotides, probe II) was next hybridized with the combined thrombin to form a sandwich type structure. Streptavidin modified QDs (avidin-QDs) were bound to probe II via the biotin-avidin-system. The QDs ECL signal was responsive to the amount of probe II, which was indirect proportional to the combined thrombin. The ECL intensity of the biosensor increased with the increase of thrombin concentration in the range of 0-20 microgmL(-1). In addition, the biosensor exhibited the excellent selectivity responses and good stability toward the target analyte.