组成图示
示意图生成中
传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)、磷酸肌酸激酶 (creatine phosphokinase, CPK)、糖原磷酸化酶 (glycogen phosphorylase)、过氧化物酶体过氧化物酶 1 (peroxiredoxin 1, Prx1)；样品基质：纯化蛋白溶液（50 mM KP 缓冲液）
检测原理
CM5 芯片表面的羧甲基葡聚糖经 EDC/NHS 活化后，5-氨基己酰-靛红或 5-氨基靛红通过氨基与羧基共价固定，形成靛红类似物识别层。目标蛋白以不同浓度注入流动池，与固定配体发生特异性结合，使芯片表面质量与折射率增加，SPR 共振角随之改变，产生响应单位。结合量随蛋白浓度升高而增加，达到平衡后响应稳定；随后用 6 M guanidine-HCl 再生，响应下降。数据按 1:1 结合模型拟合，计算 kon、koff 和 Kd，无酶促或核酸放大。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
亲和层析中约 4% 脑蛋白被 5-氨基己酰-靛红-Sepharose 特异吸附，对照 Sepharose 非特异结合低于 1%。大鼠和小鼠分别鉴定出 64 和 65 种靛红结合蛋白，仅 21 种相同，约三分之一。SPR 验证显示 GAPDH、磷酸肌酸激酶、糖原磷酸化酶和过氧化物酶体过氧化物酶 1 均与两种固定配体特异性结合，Kd 范围为 10^-8–10^-5 M，且不同蛋白对两种类似物亲和力不同。每种蛋白至少经三次独立实验确认。作者认为该传感器可用于验证蛋白组学鉴定的结合蛋白，并解释大鼠与小鼠对靛红效应差异及神经退行性疾病靶标。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5 传感器芯片，含亲水羧甲基葡聚糖基质，提供 SPR 换能表面与羧基偶联位点
- 活化层：EDC/NHS 胺偶联体系，活化羧基形成氨基反应性中间体
- 识别元件：5-aminocaproyl-isatin 或 5-aminoisatin，共价固定于芯片，作为靛红类似物亲和配体捕获目标蛋白
- 封闭层：ethanolamine-HCl，灭活未反应活化基团，降低非特异结合
- 被测物：GAPDH、creatine phosphokinase、glycogen phosphorylase、peroxiredoxin 1 等纯化蛋白，溶于 50 mM KP 缓冲液
- 再生层：6 M guanidine-HCl，洗脱结合蛋白并再生芯片表面
- 读出层：Biacore 3000 SPR 光学系统，监测表面折射率变化并输出 sensorgram
中文摘要
靛红（isatin，吲哚-2,3-二酮）是一种内源性吲哚，在脑及其他哺乳动物组织和体液中呈不连续分布，应激和焦虑时其水平升高。靛红及其类似物具有多种药理活性，但具体生物学靶标仍不清楚。作者将 Triton X-100 裂解的大鼠和小鼠全脑匀浆可溶及颗粒组分在 5-氨基己酰-靛红-Sepharose 亲和柱上分离，并经蛋白组学分析，分别鉴定出 64 和 65 种结合蛋白。随后利用 Biacore 3000 光学生物传感器，以 5-氨基己酰-靛红和 5-氨基靛红为亲和配体，验证部分蛋白的靛红结合能力。所得 Kd 值（0.1–20 mM）与既往 [3H]靛红结合脑切片的 Kd 范围一致。尽管两种动物鉴定出的结合蛋白数量相近，但仅 21 种蛋白相同，这可能解释文献中靛红在大鼠和小鼠中效应差异。
英文摘要
Isatin (indole-2,3-dione) is an endogenous indole that has a distinct and discontinuous distribution in the brain and in other mammalian tissues and body fluids. Its output is increased under conditions of stress and anxiety. Isatin itself and its analogues exhibit a wide range of pharmacological activities but its specific biological targets still are not well characterized. Affinity chromatography of Triton X-100 lysates of soluble and particulate fractions of mouse and rat whole brain homogenates on 5-aminocaproyl-isatin-Sepharose followed by subsequent proteomic analysis resulted in identification of 65 and 64 individual proteins, respectively. Isatin-binding capacity of some of the identified proteins has been validated in an optical biosensor study using a Biacore 3000 optical biosensor, 5-aminocarproyl-isatin, and 5-aminoisatin as the affinity ligands. The K(d) values (of 0.1-20 microM) obtained during the optical biosensor experiments were consistent with the range of K(d) values recently reported for [(3)H]isatin binding to brain sections. Although the number of isatin-binding proteins identified in the mouse and rat brain was similar, only 21 proteins (about one-third) were identical in the two species. This may be one reason for the differences in isatin effects in rats and mice reported in the literature.