组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
DJ-1 蛋白（DJ-1）及其 L166P 突变体的分子伴侣折叠活性与同源二聚化状态；样品基质：SH-SY5Y 细胞、CSM 14.1 细胞、HEK293T 细胞（完整细胞及细胞裂解液）
检测原理
cdYFP 因点突变存在折叠缺陷，色原团形成受阻，YFP 荧光较弱。当细胞内 DJ-1 发挥分子伴侣活性时，促进 cdYFP 正确折叠，YFP 荧光增强；HA 标记的 cdYFP 用 anti-HA/Cy5 二抗标记，作为总浓度参考，YFP/Cy5 比值随 DJ-1 折叠酶活性升高而升高。L166P 突变使 DJ-1 二聚化受损，折叠活性消失。CFP-DJ-1 与 YFP-DJ-1 接近时发生 FRET，CFP 荧光寿命缩短，FRET 效率反映二聚化程度；BAG1 可恢复 L166P 二聚化和伴侣活性，使信号回到野生型水平。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
BAG1 与内源及重组 DJ-1 结合，DJ-1 siRNA 可消除信号，BAGΔC 不结合，提示特异性。FRET/FLIM 显示野生型 DJ-1 FRET 效率约 25%，L166P 约 10%，BAG1 使突变体接近野生型（n=15，P<0.001）。cdYFP 检测中，野生型 DJ-1 使折叠活性中位数提高约 3 倍，最高 8–10 倍；L166P 无活性，BAG1 恢复至 BAG1 增强野生型水平（n=10，P<0.01/0.001）。L166P 诱导细胞死亡约 20%，BAG1 降至 8%，BAGΔC 无效（n=2000，P<0.0001）。实验重复至少三次，作者认为 BAG1 可恢复 DJ-1 功能，具潜在治疗价值。
传感器的构成
- 细胞基质：SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞、CSM 14.1 神经元样细胞或 HEK293T 细胞，提供表达、成像与功能检测环境
- 表达/转染层：Lipofectamine 2000 介导的 cDNA 瞬时转染，导入 DJ-1、BAG1、cdYFP 及荧光融合蛋白
- 识别/响应元件：cdYFP（chaperone-dependent YFP），含折叠缺陷点突变，分子伴侣活性促进其折叠并产生 YFP 荧光
- 浓度参考标记：HA 标签 cdYFP 经 anti-HA 抗体与 Cy5 二抗标记，作为惰性浓度参考用于归一化
- 二聚化传感标记：CFP-DJ-1 与 YFP-DJ-1 融合蛋白，通过 FRET/FLIM 检测 DJ-1 同源二聚化
- 换能/读出系统：共聚焦激光扫描显微镜（SP2）或频域 FLIM 系统，采集 YFP/CFP 荧光强度与寿命并计算折叠活性/FRET 效率
中文摘要
DJ-1 基因突变可导致常染色体隐性早发型帕金森病，DJ-1 功能缺失被认为是致病机制，但其功能仍有争议。本研究显示，DJ-1 定位于胞质，并以同源二聚体形式与膜及细胞器相关；致病突变 L166P 使其亚细胞分布转向细胞核，降低二聚化能力，损害细胞存活。利用细胞内折叠酶生物传感器 cdYFP，作者发现野生型 DJ-1 具有分子伴侣活性，而 L166P 突变完全丧失该活性。进一步发现辅伴侣 BAG1 可逆转这一异常表型，恢复 DJ-1 的亚细胞分布、二聚体形成和伴侣活性，并改善细胞存活。结果提示 DJ-1 以二聚体形式发挥强折叠酶活性，BAG1 可能为 DJ-1 相关帕金森病提供潜在治疗策略。
英文摘要
Mutations in the gene coding for DJ-1 protein lead to early-onset recessive forms of Parkinson's disease. It is believed that loss of DJ-1 function is causative for disease, although the function of DJ-1 still remains a matter of controversy. We show that DJ-1 is localized in the cytosol and is associated with membranes and organelles in the form of homodimers. The disease-related mutation L166P shifts its subcellular distribution to the nucleus and decreases its ability to dimerize, impairing cell survival. Using an intracellular foldase biosensor, we found that wild-type DJ-1 possesses chaperone activity, which is abolished by the L166P mutation. We observed that this aberrant phenotype can be reversed by the expression of the cochaperone BAG1 (Bcl-2-associated athanogene 1), restoring DJ-1 subcellular distribution, dimer formation, and chaperone activity and ameliorating cell survival.