组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
小分子化合物库（small molecule compound libraries，如 quinacrine/阿的平）；样品基质：PBS 运行缓冲液，水溶性或含 6.5% DMSO
检测原理
CM5 芯片金表面的 CM-dextran 羧基经 EDC/NHS 活化形成活性酯，与重组 flhPrPC 的氨基共价偶联，随后用乙醇胺封闭未反应位点。将 40 μM 小分子化合物以 PBS 或含 6.5% DMSO 的 PBS 注入测试通道，化合物与固定 PrPC 结合后，界面附近质量增加，改变金表面局部折射率，使表面等离子体共振条件发生偏移，Biacore 3000 以共振单位（RU）记录结合与解离曲线。结合响应随化合物浓度升高而增大并趋于饱和，解离相反映结合稳定性；DMSO 样品通过多浓度 DMSO 校准校正溶剂效应。该方案无酶或核酸放大，依靠约 4000 RU 的 PrPC 固定量放大小分子结合信号，并用 Langmuir 1:1 模型拟合 Kd。
检测灵敏度
基线噪声: 5–10 RU；小分子结合要求: 40–100 RU；quinacrine Kd: Kd is estimated as 15 μM
效应效果
该方案用于化合物库初筛和阳性结合物亲和定量，而非临床样品检测。通过参考通道扣除非特异结合，并用 5.5%、6%、6.5%、7%、7.5% DMSO 校准块校正溶剂效应；表面经 NaOH/NaCl 和 glycine-HCl 再生后可重复使用，芯片通常使用 5 天。固定 PrPC 约 4000 RU，基线噪声 5–10 RU，要求小分子结合产生 40–100 RU 响应；示例 quinacrine 的 Kd 估计为 15 μM。未报告 RSD、回收率或与 ELISA/qPCR 对比。作者认为 SPR 易于实施、中等通量、自动进样，适合发现结合 PrPC 的抗朊病毒先导化合物，阳性物需细胞实验验证。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5 传感器芯片（金表面，Biacore 3000 SPR 换能器）
- 修饰层：CM-dextran（羧甲基葡聚糖）层，提供羧基用于共价偶联
- 偶联试剂：EDC/NHS 混合液，活化羧基形成活性酯并偶联 PrPC
- 识别元件：重组全长人 PrPC（flhPrPC），固定于测试通道作为靶蛋白
- 封闭剂：1 M ethanolamine，封闭未反应表面位点
- 信号标记物：无外源标记，小分子结合直接改变界面折射率
中文摘要
朊病毒病又称传染性海绵状脑病（TSEs），是一类累及动物和人类的神经退行性疾病，包括绵羊痒病、牛海绵状脑病、鹿慢性消耗病、人类克雅病及变异型克雅病等。疾病进展与细胞朊蛋白（PrPC）转变为蛋白酶抗性、不溶性错误折叠朊蛋白（PrPSc）并形成淀粉样沉积密切相关，因此 PrPC 和 PrPSc 均被视为潜在药物靶点。由于 PrPSc 不溶且难以大量制备，亲和筛选通常采用更易获得的重组 PrPC 作为靶蛋白，再用细胞实验验证候选物的抗朊活性。本文给出一种优化的 SPR 实验方案，利用 Biacore 3000 将重组 PrPC 固定于传感器芯片表面，对化合物库进行亲和筛选，以发现可结合 PrPC 的潜在抗朊病毒先导化合物。
英文摘要
Prion diseases, also called transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), are a group of neurodegenerative disorders affecting animals and humans. No effective treatments are currently available for the diseases, vCJD in particular. It is believed that the formation of protease-resistant insoluble prion protein (PrP(Sc)), which is the main component of amyloidal deposits, from the cellular prion protein (PrP(C)), is essential for the progression of the disease. Therefore, both PrP(Sc) and PrP(C) are currently being used as potential drug targets.This protocol details an optimised experimental protocol to conduct an affinity screening of compound libraries by the immobilisation of PrP(C) using an SPR-based instrument, Biacore 3000.