组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
转导蛋白（transducin, Gt）；样品基质：MOPS运行缓冲液中的纯化Gt（源自牛杆状细胞外段）
检测原理
CM5芯片经EDC/NHS活化后共价固定ConA，ConA通过甘露糖链捕获暗适应视紫红质的氨基端，使其胞内端暴露于流动相。转导蛋白Gt注入MOPS运行缓冲液时，暗态视紫红质与Gt结合很弱。532 nm激光照射芯片使视紫红质中11-顺式视黄醛异构化，受体转变为Meta II活性构象，催化Gt α亚基GDP/GTP交换，Gt结合到芯片表面。结合使界面质量与折射率增加，SPR共振条件改变，Biacore记录为共振单位RU上升；Gt浓度越高，结合量与RU响应越大。加入200 μM GTP可诱导Gt快速解离，RU下降，从而实现结合/解离动力学监测。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法可在SPR芯片上直接进行光触发G蛋白结合分析。激光照射对SPR信号干扰很小，最大约1–2 RU，接近系统噪声；暗态下Gt的非特异结合或预漂白视紫红质结合可通过对照扣除。Gt样品必须彻底去除GTP，否则结合显著降低。CHAPS溶解释放的视紫红质在芯片上可保持数天活性，优于其他去污剂。ConA表面约可重复20–30个固定化-再生循环，但固定量随循环下降，新鲜表面结合容量最高。9-cis-retinal在线再生视紫红质不完全，最好恢复约90%的Gt结合活性。作者认为该SPR平台适合定量研究GPCR信号和膜蛋白相互作用。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5传感器芯片（Biacore），含羧甲基化基质，作为SPR换能基底。
- 活化层：EDC/NHS，活化CM5芯片羧基，用于共价偶联ConA游离氨基。
- 捕获/识别元件：刀豆蛋白A（ConA），固定化后通过甘露糖富集寡糖链定向捕获视紫红质氨基端。
- 封闭剂：乙醇胺，封闭未反应羧基，减少非特异结合。
- 受体识别元件：视紫红质（rhodopsin），由CHAPS溶解释放，暴露胞内端与Gt结合。
- 光触发元件：532 nm Nd:YAG激光与光纤，照射芯片触发视紫红质光活化。
- 读出/再生：Biacore 2000 SPR仪记录共振单位（RU）；9-cis-retinal再生受光视紫红质。
中文摘要
G蛋白偶联受体视紫红质是七次跨膜螺旋受体的经典范例，它可被光激发并将光信号传递至G蛋白介导的级联反应。该受体触发级联中的许多组分可从天然来源以天然形式纯化，因而非常适合生物物理研究。细胞信号转导研究的核心在于定量理解蛋白质-蛋白质相互作用。表面等离子共振（SPR）光谱是一种基于生物传感器的技术，可通过测定动力学参数研究分子相互作用。本文展示了如何将暗适应视紫红质固定化在传感器芯片表面。在SPR系统中集成激光装置后，可触发视紫红质的光诱导构象变化，并监测光依赖性的视紫红质与光感受器细胞G蛋白转导蛋白（transducin, Gt）的结合。传感器芯片表面可再生并用于多轮相互作用分析。此外，受光照的视紫红质可通过在芯片表面施加9-顺式视黄醛进行再生。
英文摘要
The G-protein coupled receptor rhodopsin is a classical example of a seven transmembrane helix receptor; it is photoexcited and transmits this light signal to a G-protein mediated cascade. Many components of this receptor-triggered cascade can be purified in their native forms from natural sources making this system most suitable for biophysical studies. A central aspect of cellular signal transduction routes is to understand protein-protein interactions in a quantitative way. Surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy is a biosensor-based technique that allows investigating molecular interactions by determining kinetic parameters. We here show how dark-adapted rhodopsin can be immobilized on the sensor chip surface. A laser device implemented in the SPR system allowed us to trigger light-induced conformational changes in rhodopsin and to monitor light-dependent binding of the photoreceptor cell G-protein transducin to rhodopsin. The sensor chip surface can be regenerated and used for several rounds of interaction analysis. Furthermore, illuminated rhodopsin can be regenerated by applying 9-cis-retinal on the sensor chip surface.