组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
人源基质金属蛋白酶-3（MMP-3，cMMP-3）活性、基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）和GM6001对MMP-3的抑制；样品基质：含Brij-35的Tris-HCl反应缓冲液（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、0.5 mM ZnCl2）。
检测原理
在胺化金阵列上物理吸附明胶形成约2.5 nm底物层。加入含cMMP-3和Brij-35的反应缓冲液后，cMMP-3以Ca2+/Zn2+依赖方式水解明胶肽键，使表面明胶层质量减少、厚度降低，进而改变金表面附近局部折射率。根据SPR原理，金属表面折射率变化引起共振波长移动；明胶被水解越多，SPR波长向短波方向偏移越大。光谱SPR仪器以线扫描模式读取各阵列点SPR波长，计算Δλ=λgel−λMMP，从而定量MMP-3活性。加入TIMP-1或GM6001后，酶活性被抑制，明胶水解减少，Δλ降低，实现抑制剂筛选。
检测灵敏度
检测范围: 50 ng ml−1 to 20 µg ml−1 cMMP-3
效应效果
该传感器无需荧光标记，直接以明胶水解引起SPR波长偏移定量MMP-3活性。优化条件为10 µg/mL Brij-35、37℃孵育60 min。与荧光Cy3-明胶阵列相比，SPR阵列在50 ng/mL cMMP-3即显著增加，而荧光阵列需500 ng/mL，说明SPR更敏感。物理吸附明胶阵列活性高于共价修饰阵列，后者为前者的46±60%。AFM显示明胶层厚度由约2.5 nm降至<0.1 nm。TIMP-1和GM6001呈剂量依赖抑制，IC50分别为30.4 nM和71.5 nM，与文献一致；溶液荧光肽底物法GM6001 IC50为88.7 nM。作者认为系统简单、快速、无标记、高通量，适用于MMP抑制剂筛选和活性蛋白质组学。
传感器的构成
- 基底/换能器：Pyrex玻璃上Ti/Au（50/450 Å）金阵列，作为SPR换能金属表面和阵列点。
- 疏水隔离层：十八烷基三氯硅烷（OTS）修饰玻璃表面，在金点间形成疏水屏障，防止蛋白点间混合。
- 自组装单分子层：0.1 mM 11-巯基十一烷酸（MUA）与0.9 mM 6-巯基己醇混合自组装，提供羧基/羟基并降低非特异吸附。
- 胺化修饰层：NHS/EDC活化后与乙二胺（EDA）反应，将表面羧基转化为氨基，用于明胶物理吸附。
- 底物/识别层：明胶（gelatin）物理吸附于胺化表面，作为MMP-3天然底物，被酶水解后引起SPR信号变化。
- 反应辅助层：含Brij-35的Tris-HCl反应缓冲液（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、0.5 mM ZnCl2），维持cMMP-3催化活性。
- 信号读出：自制光谱SPR生物传感器，采用Kretschmann几何、熔融石英棱镜和线扫描模式，读取SPR波长偏移。
中文摘要
我们开发了一种基于阵列的光谱表面等离子共振（SPR）生物传感器检测系统，用于高通量分析基质金属蛋白酶（MMP）-3 活性。通过在胺修饰金阵列上固定 MMP-3 底物明胶制备明胶阵列，并通过监测明胶蛋白水解引起的 SPR 波长偏移来测定 MMP-3 活性。SPR 光谱、原子力显微镜和荧光蛋白阵列验证了 MMP-3 的明胶酶活性，该活性导致 SPR 波长下降。三种非离子去污剂以剂量依赖方式增强 MMP-3 活性，其中 Brij-35 效果最好。该阵列型 SPR 生物传感器成功用于快速分析剂量依赖的 MMP-3 活性及其被基质金属蛋白酶组织抑制剂 1（TIMP-1）和 GM6001 的抑制。因此，这种基于光谱 SPR 生物传感器的新检测系统简单、无标记、高通量，在抑制剂筛选方面具有较强潜力。
英文摘要
We developed a novel assay system using an array-based spectral surface plasmon resonance (SPR) biosensor for a high-throughput analysis of matrix metalloproteinase (MMP)-3 activity. Gelatin arrays were fabricated by immobilizing gelatin, a MMP-3 substrate, on amine-modified gold arrays. MMP-3 activity was determined by monitoring the shift of SPR wavelength caused by gelatin proteolysis. The gelatinolytic activity of MMP-3, which caused a decrease of the SPR wavelength, was verified by SPR spectroscopy, atomic force microscopy, and fluorescence-based protein arrays. MMP-3 activity increased by three non-ionic detergents in a dose-dependent manner, and Brij-35 was most effective. The array-based SPR biosensor was successfully applied to the rapid analysis of dose-dependent MMP-3 activity and its inhibition with tissue inhibitors of metalloproteinase 1 and GM6001, MMP inhibitors. Therefore, this new assay system using a spectral SPR biosensor is simple, label-free, and high-throughput, and is likely to have a strong potential for inhibitor screening.