组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
肌醇(1,4,5)-三磷酸（Ins(1,4,5)P3/IP3）、胞内钙离子（Ca2+）；样品基质：HSY-EA1人腮腺细胞胞质
检测原理
LIBRAvIII是FRET型IP3生物传感器，由IP3R配体结合域（IP3R-LBD）与CFP/YFP荧光蛋白对融合而成。当胞内IP3浓度升高时，IP3结合IP3R-LBD引起构象变化，改变CFP与YFP之间的距离或取向，从而改变FRET效率。用430 nm激发后，CFP发射（C通道，420-500 nm）与YFP发射（Y通道，500-565 nm）的比率随IP3浓度变化；以刺激前比率为R0，计算R/R0。定量分析采用[IP3]i=Kd[ΔR(ΔRmax-ΔR)^-1]^(1/n)，其中Kd=491.5 nM、n=1.13。机械刺激使受刺激细胞局部IP3快速升高并形成胞内梯度/波；邻近细胞则通过ATP-P2Y受体-PLC-IP3通路产生较小、较慢的IP3升高。Fura-2/AM同步监测Ca2+，用于关联IP3诱导的Ca2+释放。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；报告Kd: 491.5 nM；Hill系数: 1.13；ATP EC50: ~5.9 μM。
效应效果
该传感器在21/21个受刺激HSY-EA1细胞中均检测到LIBRAvIII比率升高，并与Fura-2钙响应同步。FRAP显示光漂白区荧光至少60 s不恢复，排除扩散造成波状响应；LIBRAvN和ionomycin均不引起比率升高，说明信号特异性反映[IP3]i。U-73122消除IP3响应及相应Ca2+释放；suramin或apyrase完全阻断邻近细胞响应，但不影响受刺激细胞，表明受刺激细胞IP3生成主要ATP非依赖。受刺激细胞最大[IP3]i升高303±31 nM，邻近细胞123±24 nM；t1/2分别为4.3±0.3 s和15±3.7 s。ATP EC50约5.9 μM，机械刺激响应快于1 mM ATP。未报告RSD、回收率或与ELISA等对比。作者认为该方法可实时定量活细胞机械信号转导中的IP3动态。
传感器的构成
- 表达基底：HSY-EA1人腮腺细胞，作为活细胞表达与检测平台，维持胞内pH和离子环境
- 转染修饰层：Lipofectamine 2000，用于瞬时转染LIBRAvIII或LIBRAvN质粒
- 识别元件：Ins(1,4,5)P3受体配体结合域（IP3R-LBD），特异性结合胞内IP3
- 供体荧光标记：青色荧光蛋白（CFP），作为FRET供体
- 受体荧光标记：黄色荧光蛋白（YFP），作为FRET受体
- 对照元件：IP3不敏感变体LIBRAvN，用于排除非特异性荧光变化
- 钙指示剂：Fura-2/AM，同步监测胞内Ca2+浓度并验证膜完整性
- 读出系统：AQUACOSMOS/ASHURA荧光成像系统，采集CFP/YFP与Fura-2比率信号
中文摘要
本研究在HSY-EA1细胞中考察肌醇(1,4,5)-三磷酸[Ins(1,4,5)P3]生成对机械刺激诱导Ca2+响应的贡献。利用Ins(1,4,5)P3生物传感器LIBRAvIII，机械刺激引起受刺激区域胞浆[IP3]i局部升高，并随刺激区[IP3]i升高而像胞内IP3波一样扩展；随后邻近细胞出现短暂小幅[IP3]i升高。磷脂酶C抑制剂U-73122消除这些IP3响应及相应Ca2+释放。嘌呤能受体阻断剂suramin完全阻断邻近细胞[IP3]i升高和Ca2+释放，但不能减弱受机械刺激细胞中的响应。结果表明机械刺激诱导的IP3生成主要不依赖胞外ATP。机械刺激诱导[IP3]i升高的速度远快于超最大浓度ATP(1 mM)诱导的速度。在HSY-EA1细胞中，IP3诱导的Ca2+释放对机械刺激Ca2+响应的贡献大于Ca2+内流。
英文摘要
In the present study, the contribution of inositol (1,4,5)-trisphosphate [Ins(1,4,5)P(3)] generation on the mechanical-stimulation-induced Ca(2+) response was investigated in HSY-EA1 cells. Mechanical stimulation induced a local increase in the cytosolic concentration of Ins(1,4,5)P(3) ([IP(3)](i)), as indicated by the Ins(1,4,5)P(3) biosensor LIBRAvIII. The area of this increase expanded like an intracellular Ins(1,4,5)P(3) wave as [IP(3)](i) increased in the stimulated region. A small transient [IP(3)](i) increase was subsequently seen in neighboring cells. The phospholipase C inhibitor U-73122 abolished these Ins(1,4,5)P(3) responses and resultant Ca(2+) releases. The purinergic receptor blocker suramin completely blocked increases in [IP(3)](1) and the Ca(2+) release in neighboring cells, but failed to attenuate the responses in mechanically stimulated cells. These results indicate that generation of Ins(1,4,5)P(3) in response to mechanical stimulation is primarily independent of extracellular ATP. The speed of the mechanical-stimulation-induced [IP(3)](i) increase was much more rapid than that induced by a supramaximal concentration of ATP (1 mM). The contribution of the Ins(1,4,5)P(3)-induced Ca(2+) release was larger than that of Ca(2+) entry in the Ca(2+) response to mechanical stimulation in HSY-EA1 cells.