组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
细胞内氯离子（chloride, Cl-）、细胞内质子/pH（intracellular pH, pHi）；样品基质：活细胞（WSS-1 人胚胎肾细胞、PC12 细胞）及大密核分泌颗粒（LDCV）、质膜/胞质区室。
检测原理
ClopHensor 的识别事件发生在 E2GFP 的氯结合位点：Cl- 结合后诱导 E2GFP 发生静态猝灭，形成非荧光蛋白群体，使 E2GFP 荧光强度随 [Cl-]i 降低；H+ 与 Cl- 以协同方式结合，因此 Cl- 亲和力随 pH 变化。488 nm 激发的绿色信号依赖 pH，458 nm 激发的青色信号位于等吸收点、不依赖 pH，543 nm 激发的 DsRedm 红色信号不依赖 Cl- 和 pH。通过绿色/青色比率 RpH 计算 pHi，青色/红色比率 RCl 计算 [Cl-]i；先由 RpH 得到 pHi，再根据 pH 依赖的 KdCl 校正 RCl，从而在同一细胞内同时获得 pHi 与 [Cl-]i 分布。该策略不依赖 FRET 或酶放大，而依靠三波长比率荧光和静态猝灭实现定量。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2；报告 pKa = 6.81 ± 0.05、KdCl = 13.1 ± 0.5 mM，活细胞 KdCl = 17.1 mM（pH 6.3）、49.2 mM（pH 7.25）。
效应效果
传感器在活细胞中可实现比率成像：选择发射窗口后，DsRed 红色通道几乎无串扰，绿色/青色通道交叉激发与交叉发射贡献最小化。WSS-1 细胞平均 pHi 7.3±0.2、[Cl-]i 19±14 mM（n=150），与文献一致；[Cl-]i 不确定度主要来自细胞间差异，离子载体钳制后减小。NPY-ClopHensor 在 PC12 细胞 LDCV 中测得 pHi 5.2±0.4（n=76）、[Cl-]i 110 mM（s.d. 48 mM）；WSS-1 细胞 LDCV 为 pHi 5.6±0.5、[Cl-]i 122±40 mM，质膜约 20 mM，LDCV 峰值约 130 mM。作者认为其可实时同时监测 Cl- 与 H+ 通量，适用于分泌颗粒成熟和胞吐研究。
传感器的构成
- 基底/换能器：活细胞内表达的 E2GFP-DsRedm 融合蛋白，以荧光发射作为光学换能信号
- 识别元件：E2GFP（T203Y 突变的 EGFP 变体），提供 Cl- 结合位点，结合 Cl- 后发生静态猝灭
- 参考荧光元件：DsRedm（DsRed monomer），提供 Cl- 和 pH 不敏感的红色参考信号
- 连接层：20 氨基酸柔性 linker（RGSASGGGGGLVPRGSASGA），连接 E2GFP 与 DsRedm
- 靶向序列：NPY 信号肽或 PalmPalm 双棕榈酰化序列，用于将传感器定位至 LDCV 或质膜
- 表达载体：pcDNA3.1(+) 真核表达载体，用于在 WSS-1 或 PC12 细胞中转染表达
中文摘要
氯离子是生物体中最丰富的阴离子，参与膜电位、神经传递、细胞体积和电荷平衡等生理过程，其稳态异常与多种疾病相关。传统荧光染料易从细胞泄漏且常需紫外激发，YFP 基氯传感器又受 pH 强烈影响，FRET 信号解释复杂。本文开发了一种非 FRET 比率型荧光生物传感器 ClopHensor，由氯敏感的 EGFP 变体 E2GFP 与氯和 pH 不敏感的 DsRed 单体融合而成。传感器利用 488 nm 激发下依赖 pH 的 E2GFP 信号、458 nm 激发下不依赖 pH 的 E2GFP 信号以及 543 nm 激发下不依赖 Cl- 和 pH 的 DsRed 信号，通过三通道比率成像同时计算细胞内 pH 和氯浓度。经离子载体钳制校准后，ClopHensor 在 WSS-1 细胞中测得平均 pHi 7.3±0.2、[Cl-]i 19±14 mM；将其靶向大密核分泌颗粒后，首次揭示 LDCV 内高氯浓度，支持 Cl- 是平衡 H+ 积累的主要抗衡离子。
英文摘要
Chloride and protons perform important closely related roles in many cellular responses. Here we developed a ratiometric biosensor, ClopHensor, based on a highly chloride-sensitive Aequorea victoria GFP variant that is suited for the combined real-time optical detection of pH changes and chloride fluxes in live cells. We detected high chloride concentration in large dense-core exocytosis granules by targeting ClopHensor to these intracellular compartments.