近红外（NIR）探针因组织穿透深、光毒性低、散射少，是多色细胞与活体成像的理想荧光标签。本文开发小型近红外荧光纳米抗体 NIR-FbLAG16 和 NIR-FbLAG30，可无背景地可视化多种 GFP 衍生探针及生物传感器。作者还设计红移变体 NIR-Fb(718)，用于在近红外波段同时靶向多个抗原。利用 NIR-Fb 结合抗原后稳...
斑马鱼幼鱼因透明而成为研究心脏生理、病理及药物发现的有价值模型，但荧光光学映射中心脏跳动会产生运动伪影。以往通过敲低心肌肌钙蛋白T2A或使用肌球蛋白抑制剂消除心脏运动，但这些方法会破坏机械-电与机械-机械偶联机制。本研究采用比率型基因编码生物传感器，在完整斑马鱼幼鱼跳动的心脏中成像钙离子，因为比率定量可校正运动伪影。结果显示，无论通...
FRET 生物传感器比率成像的准确性受信噪比限制，尤其在细胞边缘等低体积区域，背景扣除和除以小数值会产生明显伪影。本文提出噪声校正因子（NCF）方法，不再分别对分子和分母做背景扣除，而仅从 FRET 分子中扣除一个由背景噪声分布或高信噪比区域比率推导的校正因子，从而避免边缘处除以弱信号造成的偏差。作者首先用均匀分布且不相互作用的 m...
荧光共振能量转移（FRET）生物传感器是生物医学、药理学、毒理学和食品科学中广泛使用的有效分析工具。其核心机制是供体荧光团受激发后，通过偶极-偶极相互作用将能量非辐射转移至受体，从而实现细胞过程、分子组分和生物相互作用的比率成像。多种FRET传感器已在活细胞、组织和生物体中揭示病理状态的基础机制，并与现有生物分析技术结合，实现准确、...
溶酶体是细胞内大分子降解的关键场所，其腔内 pH 通常约为 4.5。为更准确地研究溶酶体 pH，作者设计了一种新型基因编码荧光蛋白 pH 生物传感器 FIRE-pHLy。该传感器通过溶酶体相关膜蛋白 1（LAMP1）靶向溶酶体膜，并利用单体青色荧光蛋白 1（mTFP1）作为腔侧 pH 敏感报告域，在 pH 3.5–6.0 范围内报告...
长发射波长的比率型指示剂在现代生物成像与生命科学中具有重要价值。本文利用稳态吸收、二维荧光、飞秒瞬态吸收光谱及量子化学/分子动力学计算，阐明了独立红色荧光蛋白（RFP）钙离子生物传感器REX-GECO1的工作机制。在480 nm激发下，未结合Ca2+的REX-GECO1生色团易被捕获于激发态暗态，荧光较弱；Ca2+结合后，钙调蛋白（...
细胞内pH是调控细胞代谢、内吞-溶酶体加工和肿瘤微环境的关键参数，其失调既可引发也可指示病理状态。现有荧光pH探针多基于单一酸碱平衡，动态范围通常仅约1个pH单位，难以覆盖正常细胞中从线粒体约pH 8到溶酶体约pH 4.5的宽范围。本文报道一种基于共轭香豆素-三嗪骨架的荧光pH生物传感器，可在可见光范围激发，并以单一荧光单元在超过6...
本研究开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的细胞内pH纳米探针，以克服紫外激发穿透深度浅、光稳定性差、光毒性以及背景自荧光干扰等限制。该探针以上转换纳米颗粒（UCNP，激发/发射约980/540 nm，绿色通道）为供体，以mOrange荧光蛋白（激发/发射约548/566 nm，红色通道）为受体。UCNP-mOrange纳米探...
异常铜含量与阿尔茨海默病、威尔逊病等多种疾病密切相关，但传统铜检测方法多依赖有创取样，难以实现活体深组织的非侵入、准确检测。本文报道了一种用于 Cu2+ 比率光声（PA）成像的纳米探针 NRh-IR-NMs。该探针由选择性 Cu2+ 响应探针 NRh 作为指示剂、对 Cu2+ 无响应的近红外染料 IR820（IR）作为内参，共同封装...
荧光蛋白（FP）生物传感器是追踪活体系统中金属离子运动的重要工具，但其光照后的工作原理仍不清楚。为支持生物传感器的理性设计，作者利用飞秒受激拉曼光谱（FSRS）在电子激发态解析了新型激发比率绿色荧光蛋白钙传感器 GEX-GECO1 的荧光调制机制。400 nm 光激发后，约 1180 和 1300 cm^-1 的特征振动标记带呈现同...
基因编码的Förster共振能量转移（FRET）生物传感器可用于报告离子和小分子相对浓度、蛋白构象变化、翻译后修饰及蛋白相互作用，通常通过荧光强度比率分析定量。本文以拟南芥中检测无机磷酸盐（Pi）的FRET生物传感器cpFLIPPi-6.4m为例，建立了基于共聚焦显微镜的比率成像定量方法。作者对供体eCFP、受体cpVenus及FR...
基于环境敏感荧光染料的生物传感器可用于在活体中报告内源蛋白活性。染料可连接至选择性结合目标蛋白特定构象的试剂，结合后引起荧光变化。适用于低浓度、非扰动细胞内检测的明亮染料通常只发生荧光强度变化，而非激发或发射峰位移，因此难以通过比率成像精确量化。本文报道了一种环境敏感染料 mero199，其激发峰随溶剂极性发生 33 nm 位移。利...
荧光生物传感器现已常规用于完整组织的双光子显微镜成像，例如脑片和活体动物脑。然而，多数研究测量的是时间变化，例如神经元活动引起的钙瞬变，而非经校准的生物传感器占据率（即被测分析物水平）。真正的定量测量具有挑战性，因为难以或无法在体内原位校准传感器的剂量–响应关系，也难以将组织中的光学信号与体外校准信号进行比较。双波长比率测量会受激光...
本文报道了一类基于二聚化依赖荧光蛋白（ddFP）异二聚体伙伴可逆交换的遗传编码荧光生物传感器。ddFP由含色团的A拷贝（绿色GA或红色RA）和不形成色团但可显著增强A拷贝荧光的B拷贝组成；GA与RA均可与互补B拷贝结合形成荧光异二聚体。作者利用B拷贝在GA与RA之间的竞争性交换，使蛋白酶切割、Ca2+结合、PIP2水解、cAMP/P...
本章首先简要介绍荧光与荧光共振能量转移（FRET）的基本原理，随后重点讨论记录FRET最常用的方法，尤其关注广泛用于生物传感器成像的显微镜技术。文中比较了宽场荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜的仪器选择，说明基于强度（如比率成像、受体光漂白）和基于供体荧光寿命（FLIM）的FRET检测方式，并给出将特定记录方法与具体科学实验相匹配的指...
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器可用于在活细胞中以亚细胞分辨率和秒级时间尺度解析蛋白激活事件的动态过程，这些过程难以用传统生化和细胞生物学方法直接观察。本文系统介绍将 FRET 生物传感器原始图像数据转化为相对比率定量测量的基本图像处理流程，重点讨论遗传编码单链 FRET 传感器以及分子间双链设计系统的处理...
锌离子在缺血性卒中、癫痫持续状态和创伤性脑损伤后的细胞毒性作用仍有争议，但可能源于线粒体功能障碍。本文报道了一种基于人碳酸酐酶II（CA II）变体的激发比率荧光生物传感器，并将其表达于线粒体基质，用于定量成像其中的游离锌水平。在PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞培养系中，作者测得线粒体基质平均游离锌浓度约为0.2 pM。随后在细胞氧葡萄糖...
活细胞荧光生物传感器通常需要繁琐优化，且依赖具有合适靶标特异性的天然配体。本文报道了一种基于工程化纤连蛋白III型单体（FN3 monobody）支架的荧光生物传感器，可通过高通量筛选改造为结合不同靶标的探针。作者以特异性识别激活态Src家族激酶（SFK）的monobody 1F11为基础，在其表面连接一种亮的环境敏感荧光染料，使染...
氯离子是生物体中最丰富的阴离子，参与膜电位、神经传递、细胞体积和电荷平衡等生理过程，其稳态异常与多种疾病相关。传统荧光染料易从细胞泄漏且常需紫外激发，YFP 基氯传感器又受 pH 强烈影响，FRET 信号解释复杂。本文开发了一种非 FRET 比率型荧光生物传感器 ClopHensor，由氯敏感的 EGFP 变体 E2GFP 与氯和 ...