组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
激活态Src家族激酶（Src-family kinases, SFKs；Src SH3域）、内源未修饰SFK；样品基质：活细胞（NIH 3T3 MEFs、PTK1细胞）及细胞裂解液（GN4细胞）
检测原理
该传感器以FN3 monobody 1F11为识别元件，特异性结合激活态SFK暴露的SH3域。环境敏感merocyanine染料mero53通过碘乙酰胺共价连接在1F11的Cys24位点，靠近结合界面。未结合时染料处于极性水环境，荧光较弱；当1F11结合激活态SFK后，染料局部微环境变疏水，溶剂可及表面积降低，mero53荧光增强约50%。mCerulean（C48S）作为参考荧光蛋白，染料/mCerulean发射比升高，可归一化细胞厚度与光照不均。直接激发染料（>580 nm）提高信噪比，使低浓度传感器即可检测内源未修饰SFK。SFK激活程度越高，结合比例越高，比率信号越强。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
1F11选择性结合SFK，不结合近缘激酶；ciglitazone处理后pull-down增加，pervanadate抑制，且结合不阻断激酶活性。最终C24-mero53对Src SH3亲和力约500–600 nM。活细胞中mCerulean融合消除囊泡化；非结合P78A对照无响应。PP2处理3 min内消除高荧光比和边缘定位。PDGF刺激下背侧皱褶SFK活性升高，闭合时下降。PTK1细胞270,460条线扫描显示活性在距边缘1–2 μm处峰值，且与突起速度正相关；1 μm处PP2前后差异约0.08（P<0.001）。作者认为该支架可高通量生成活细胞荧光传感器。
传感器的构成
- 识别元件：FN3 monobody 1F11，工程化纤连蛋白III型单体，特异性识别激活态SFK的SH3域
- 信号标记物：merocyanine染料mero53，环境敏感荧光染料，经碘乙酰胺共价连接至1F11 Cys24，靶标结合后荧光增强
- 比率参考元件：mCerulean（C48S）荧光蛋白，融合于1F11 N端，提供比率成像参考并消除囊泡化
- 连接元件：柔性linker，连接mCerulean与1F11，恢复染料荧光响应
- 制备纯化层：大肠杆菌表达1F11-mCerulean融合蛋白，G-25凝胶过滤去除游离染料，染料/蛋白摩尔比0.8–1.1
- 递送/样品基质：微注射进入NIH 3T3 MEF或PTK1活细胞，检测内源未修饰SFK
- 读出系统：荧光显微镜比率成像，记录mero53/mCerulean发射比
中文摘要
活细胞荧光生物传感器通常需要繁琐优化，且依赖具有合适靶标特异性的天然配体。本文报道了一种基于工程化纤连蛋白III型单体（FN3 monobody）支架的荧光生物传感器，可通过高通量筛选改造为结合不同靶标的探针。作者以特异性识别激活态Src家族激酶（SFK）的monobody 1F11为基础，在其表面连接一种亮的环境敏感荧光染料，使染料在靶标结合后荧光增强。通过筛选染料连接位点并引入mCerulean荧光蛋白，消除了活细胞中的囊泡化，建立了可推广的传感器支架。该方法检测内源未修饰靶标，并通过直接激发染料提高灵敏度，从而降低细胞扰动。自动关联细胞边缘速度与SFK活性显示，SFK在细胞突起过程中特异性激活，活性与速度相关，并在前缘1–2 μm处达到峰值。
英文摘要
Fluorescent biosensors for living cells currently require laborious optimization and a unique design for each target. They are limited by the availability of naturally occurring ligands with appropriate target specificity. Here we describe a biosensor based on an engineered fibronectin monobody scaffold that can be tailored to bind different targets via high-throughput screening. We made this Src-family kinase (SFK) biosensor by derivatizing a monobody specific for activated SFKs with a bright dye whose fluorescence increases upon target binding. We identified sites for dye attachment and changes to eliminate vesiculation in living cells, providing a generalizable scaffold for biosensor production. This approach minimizes cell perturbation because it senses endogenous, unmodified target, and because sensitivity is enhanced by direct dye excitation. Automated correlation of cell velocities and SFK activity revealed that SFKs are activated specifically during protrusion. Activity correlates with velocity, and peaks 1-2 μm from the leading edge.