Spatiotemporal ATP Dynamics during AKI Predict Renal Prognosis.
背景：肾小管细胞 ATP 耗竭在肾脏疾病发病机制中起核心作用，但体内 ATP 时空分布与动态难以可视化。方法：作者利用全身表达 FRET 型 ATP 生物传感器 GO-ATeam（由 ATP 合酶 ε 亚基与两种荧光蛋白组成）的 GO-ATeam2 小鼠，通过双光子显微镜在单细胞分辨率下观察热缺血再灌注和冷缺血再灌注过程中的 ATP...
Experimental pathology by intravital microscopy and genetically encoded fluorescent biosensors.
双光子激发显微镜的发明扩大了活体显微镜（IVM）在实验病理学中的应用潜力。近年来，基于荧光蛋白的遗传编码生物传感器为在活体动物中可视化细胞功能提供了理想工具。本文首先简要回顾双光子激发显微镜下的活体显微镜技术，以及基于 Förster 共振能量转移（FRET）原理的遗传编码生物传感器。随后，作者描述利用这些生物传感器开展活体成像如何...
A Novel Morphological Marker for the Analysis of Molecular Activities at the Single-cell Level.
组织学长期依赖苏木精-伊红（H&E）染色，但活体多光子成像尚未充分利用，因为缺乏合适的形态标记。本文报道一种遗传编码荧光形态标记 NuCyM（Nucleus, Cytosol, and Membrane），旨在活体内重现 H&E 染色模式。作者利用 ROSA26 细菌人工染色体（BAC）构建普遍表达 NuCyM 的转基因小鼠。NuC...
Activation of Erk in ileal epithelial cells engaged in ischemic-injury repair.
肠上皮细胞构成保护机体免受病原体和膳食物质侵害的物理屏障，因此其损伤必须迅速修复。多项体内和体外研究表明细胞外信号调节激酶（Erk）参与再生过程，但 Erk 活性与组织形态相关的空间调控尚未充分阐明。本研究利用双光子显微镜和携带 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的小鼠，在活体小鼠回肠上皮细胞中实时监测 Erk 活性...
Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.
在实验性自身免疫性脑炎（EAE）中，自身免疫 T 细胞先在周围组织激活，再进入中枢神经系统（CNS）。途中 T 细胞经过不同微环境，接收基质细胞及有无自身抗原的信号，获得侵袭靶组织的能力。本研究在 T 细胞介导的 EAE 模型中，结合活体双光子显微镜与两种激活报告系统：FRET 钙生物传感器 Twitch1 和荧光 NFAT。体外激...
A simple approach for measuring FRET in fluorescent biosensors using two-photon microscopy.
遗传编码的荧光蛋白（FP）生物传感器可用于监测活细胞和组织中的细胞事件。由于多数探针最初针对单光子激发设计，其宽双光子激发（2PE）截面和尚未充分理解的漂白特性，使双光子激光扫描显微镜（TPLSM）应用困难。本文提出一种简化FRET型荧光生物传感器在TPLSM中使用的方案。首先利用活细胞中表达的FRET标准蛋白评估并优化TPLSM系...
Imaging of Metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM.
本文提出利用表达于肿瘤球体内的 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器，非侵入性绘制三维细胞培养中生化与生理变化的时空分布。重点报道改进的 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）FRET 生物传感器 T2AMPKAR（mTurquoise2 AMPK Activity Reporter），用于荧光寿命成像（FLIM）读出，并在...
Live imaging of transforming growth factor-β activated kinase 1 activation in Lewis lung carcinoma 3LL cells implanted into syngeneic mice and treated with polyinosinic:polycytidylic acid.
转化生长因子β激活激酶1（TAK1）在细胞死亡、分化和炎症中发挥关键作用。本研究在皮下植入Lewis肺癌3LL细胞并注射多聚肌苷酸:多聚胞苷酸（PolyI:C）的同基因C57BL/6小鼠中，活体成像TAK1的激活。作者首先开发并表征了基于Förster共振能量转移（FRET）的TAK1活性生物传感器Eevee-TAK1。该传感器对放...
A practical method for monitoring FRET-based biosensors in living animals using two-photon microscopy.
多光子显微镜系统的商业化推动了活体显微镜在完整动物细胞生物学研究中的应用，而基于荧光蛋白（FP）的生物传感器可实时监测多种细胞过程。Förster 共振能量转移（FRET）探针是检测细胞事件最灵敏的指标之一，但双光子激发（2PE）与单光子激发的差异使活体 2PE FRET 测量仍具挑战。本文提出一种简化 FRET 生物传感器用于活体...
Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors.
荧光生物传感器现已常规用于完整组织的双光子显微镜成像，例如脑片和活体动物脑。然而，多数研究测量的是时间变化，例如神经元活动引起的钙瞬变，而非经校准的生物传感器占据率（即被测分析物水平）。真正的定量测量具有挑战性，因为难以或无法在体内原位校准传感器的剂量–响应关系，也难以将组织中的光学信号与体外校准信号进行比较。双波长比率测量会受激光...
Construction of a robust and sensitive arginine biosensor through ancestral protein reconstruction.
信号分子生物传感器可结合蛋白工程、荧光成像与细胞生物学，用于研究生理过程。遗传编码生物传感器的构建通常依赖既特异又稳定的结合核心，再与荧光分子偶联形成传感元件；但自然界中常缺乏满足要求的结合蛋白，且现有传感器在稳定性方面仍需改进。祖先蛋白重建是一种可产生高稳定性功能蛋白的蛋白工程方法。本研究以 L-精氨酸为对象，利用祖先蛋白重建与环...
Heterogeneity in ERK activity as visualized by in vivo FRET imaging of mammary tumor cells developed in MMTV-Neu mice.
人表皮生长因子受体2/Neu（HER2/Neu）在约30%的乳腺癌中过表达，主要通过Ras–Raf–MEK–ERK通路传递生长信号，但乳腺癌组织中ERK活性高低与预后关系仍有争议。为阐明ERK活性在乳腺癌进展中的作用，作者将MMTV-Neu转基因小鼠与表达ERK荧光共振能量转移（FRET）生物传感器EKAREV的转基因小鼠杂交，利用...
Ca(2+) signaling in arterioles and small arteries of conscious, restrained, optical biosensor mice.
本研究利用双光子荧光显微镜和有意识固定光学生物传感器小鼠，原位检测小鼠耳部小动脉平滑肌细胞内钙离子（[Ca2+]i）。ExMLCK 小鼠在平滑肌中表达遗传编码 FRET 钙指示剂 exMLCK，并植入血压遥测装置以维持正常平均动脉压（MAP）和交感神经活动（SNA）。固定后有意识小鼠 MAP 为 101±4 mmHg，与自由活动 1...
A method for noninvasive longitudinal measurements of [Ca2+] in arterioles of hypertensive optical biosensor mice.
本研究利用双光子 Förster 共振能量转移（FRET）显微镜，对活体“生物传感器”小鼠小动脉中的细胞内钙离子浓度（[Ca2+]）进行连续、非侵入性测量。所用小鼠表达遗传编码钙指示剂（GECI），包括基于 FRET 的 exMLCK 和基于荧光强度的 GCaMP2。exMLCK 的 Rmin 与 Rmax 在离体肠系膜小动脉中测定...
Parallelized TCSPC for dynamic intravital fluorescence lifetime imaging: quantifying neuronal dysfunction in neuroinflammation.
双光子激光扫描显微镜可揭示活体动物深部组织中细胞运动与相互作用，但现有成像技术难以阐明器官功能障碍的分子基础。Förster 共振能量转移（FRET）是探测细胞功能分子机制的重要工具，而荧光寿命成像（FLIM）作为无校准方法，更适合在活体内定量 FRET，其主要限制是深部组织三维/四维成像中的采集速度。本文提出一种并行化时间相关单光...
Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.
荧光蛋白成像技术的进步揭示了发育生物学中的多种生物过程。特别是基于荧光共振能量转移（FRET）原理的遗传编码生物传感器，已被用于在活细胞中可视化胞内信号分子的空间与时间动态。然而，高灵敏度FRET生物传感器的开发及其在发育生物学中的应用仍具挑战，限制了其广泛使用。本综述首先概述FRET生物传感器成像的一般流程与实验技巧，随后介绍FR...