组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
抗克氏锥虫免疫球蛋白G（anti-Trypanosoma cruzi IgG），样品基质为人血清（serum）
检测原理
金电极经巯基自组装和碳二亚胺活化后，将重组嵌合抗原TRX-pL-Q1通过赖氨酸氨基定向共价固定，使FRA和SAPA同源表位充分暴露。血清中抗T. cruzi IgG与固定抗原结合，随后HRP标记抗人IgG二抗结合形成免疫复合物。在3.0 mM FcMe和1.8 mM H2O2存在下，HRP催化FcMe氧化还原循环：HRP将FcMe(II)氧化为FcMe(III)，FcMe(III)在电极表面还原再生FcMe(II)，产生催化电流。抗T. cruzi IgG浓度越高，表面HRP越多，催化电流越大。定向共价固定提高表位暴露、降低非特异结合并耐受再生处理，酶催化介质循环提供信号放大。
检测灵敏度
LOD: 62 ng ml−1；R = 0.9523（与ELISA比较）
效应效果
该传感器对68个潜在干扰血清（弓形虫、梅毒、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、皮肤利什曼病）无假阳性；对15个利什曼病血清，TPH传感器特异性为40%，TRX-pL-Q1传感器达100%，不确定区由33%降至7%。TRX-pL-Q1信噪比最高为6.5，高于TPH的6.3。与商用ELISA比较，相关系数R=0.9523，LOD为62 ng/mL，低于ELISA的484 ng/mL约8倍；所有阳性样品信号高于cutoff 0.51 μA cm−2，阴性低于cutoff。经0.1 M glycine-HCl（pH 2.8）再生，解离率为88±3%，连续10次测定后保持约80%初始信号，显示可用于血库自动化筛查。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），经piranha溶液清洗，作为工作电极进行安培检测
- 巯基自组装修饰层：3-巯基-1-丙磺酸（thiol）在金表面自组装，提供可被碳二亚胺活化的酸性基团界面
- 共价活化层：1,3-二异丙基碳二亚胺（carbodiimide）活化巯基修饰表面，与蛋白赖氨酸氨基反应实现定向共价固定
- 识别元件：重组嵌合抗原TRX-pL-Q1（含TRX、pL、RP1/RP2，分别同源FRA和SAPA），捕获抗T. cruzi IgG
- 封闭剂：牛酪蛋白钠盐（bovine casein sodium salt）封闭未修饰表面位点
- 信号标记物：辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG γ链（HRP-conjugated IgG），结合捕获的抗T. cruzi IgG
- 电子供体/介质：二茂铁甲醇（ferrocenemethanol, FcMe，3.0 mM），参与HRP催化电子转移循环
- 酶底物：过氧化氢（H2O2，1.8 mM），作为HRP催化底物产生催化电流
中文摘要
临床免疫检测常具有合适灵敏度，但部分方法特异性不足，或反之。为在提高特异性与降低灵敏度之间取得折中，作者设计了采用定制嵌合受体和安培检测的间接免疫生物传感器，用于检测样品中特异性抗克氏锥虫免疫球蛋白G（IgG）。重组嵌合蛋白被设计为有利于定向共价固定，使其表位充分暴露、高效捕获分析物，并耐受强化学处理以实现传感器复用。随后结合辣根过氧化物酶标记抗人IgG二抗，在可溶性介质和酶底物存在下，测得随分析物浓度增加的电流。使用嵌合构建体的传感器对用其他生物受体出现假阳性的样品表现出100%特异性。含多赖氨酸链和硫氧还蛋白作为导向元件的蛋白显示最高信噪比（P<0.05）。检出限为62 ng/mL，比当前商用恰加斯病ELISA试剂盒低8倍。评估了传感器可重复使用性，连续10次测定后信号约为初始信号的80%。
英文摘要
Clinical immunoassays often display suitable sensitivity but some lack of specificity or vice versa. As a trade-off between specificity improvement and sensitivity loss, biosensors were designed to perform indirect immunoassays with amperometric detection using tailor-made chimeric receptors to react with the analyte, specific anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G (IgG). Recombinant chimeras were designed to favor their oriented covalent attachment. This allows the chimeras to properly expose their epitopes, to efficiently capture the analyte, and to withstand severe chemical treatment to reuse the biosensors. By further binding the secondary antibody, horseradish peroxidase-labeled anti-human IgG, in the presence of the soluble mediator and the enzyme substrate, a current that increased with the analyte concentration was measured. Biosensors using the chimeric constructions showed 100% specificity with samples that had revealed false-positive results when using other bioreceptors. A protein bearing a poly-Lys chain and thioredoxin as directing elements displayed the highest signal-to-noise ratio (P<0.05). The limit of detection was 62 ng ml⁻¹, which is eight times lower than that obtained with a currently used commercial Chagas enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. Reusability of the biosensor was assessed. The signal was approximately 80% of the original one after performing 10 consecutive determinations.