组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
水杨酸（salicylate/sodium salicylate）、萘（naphthalene，文中作为潜在检测对象）；样品基质：水样/环境水样（实验以蒸馏水配制）
检测原理
工程化大肠杆菌携带 pNRSAL 质粒，nahR 在 Pr 启动子下组成型表达 NahR。水杨酸进入细胞后与 NahR 的诱导剂识别域结合，引起构象变化并促进多聚化；NahR 结合 Psal 启动子 -65 二联序列及 -35 区域，并与 RNA 聚合酶相互作用，激活 luc 转录。荧光素酶表达后催化荧光素氧化发光，生物发光强度随水杨酸浓度升高而增强。突变改变诱导剂结合口袋或多聚化能力，实现转录级联放大，使 R248Q 在 10 μM 时响应提高约 50 倍，R248M 在 5 mM 仍响应。
检测灵敏度
WT: above 0.1 μM, best at 100 μM；突变体起始响应: above 0.1–10 μM；响应范围: 1 μM–above 5 mM；最大响应增强: about 4–50-fold；R248Q: about ∼50-fold at 10 μM, about ∼6-fold at 100 μM；N169C: about 5-fold at 100 μM；R248H: about 4-fold at 100 μM；R248M: about 6-fold at 5 mM；R248Y: about ∼10-fold at 1 mM
效应效果
特异性方面，野生型及多数突变体对苯甲酸盐、苯酚、甲苯和邻二甲苯无响应；N169C 和 R248Q 对苯甲酸盐有弱响应，但对水杨酸响应明显更高。灵敏度与现有方法相当：Fe(III) 分光光度法通常 60 μM–4 mM，酶促比色法 0–5 mM，偶联酶法 6.5 nM–1.4 μM。R248M 在 5 mM 毒性浓度下仍保持最大响应，未观察到细胞毒性，说明突变可缓解微生物传感器高浓度毒性问题。作者认为该策略可拓展高灵敏微生物传感器在环境污染物检测中的应用。
传感器的构成
- 宿主细胞/换能器：E. coli DH5α 全细胞，作为生物传感元件与反应容器，允许水杨酸进入并表达报告信号
- 表达载体：pGL3 basic 衍生质粒 pNRSAL，携带 nahR/Pr/Psal-luc 表达盒
- 识别/调控元件：nahR 编码的 LysR 型转录调控蛋白 NahR（野生型或 N169C、R248H、R248M、R248Q、R248Y 等突变体），识别水杨酸并激活下游转录
- 启动子/响应元件：Pr（nahR 组成型表达启动子）和 Psal（水杨酸诱导启动子，含 -65 二联序列与 -35 相互作用位点）
- 报告基因/信号标记：荧光素酶基因 luc（firefly luciferase），表达荧光素酶
- 信号底物：荧光素（firefly luciferin，Promega），与荧光素酶反应产生生物发光
- 裂解/检测介质：含溶菌酶（lysozyme）、BSA 和 CCLR 的裂解液，以及 KH2PO4/EDTA 缓冲液，用于裂解细胞并释放荧光素酶
- 读出仪器：LBP40 Mithras luminometer（Berthold），测量生物发光强度
中文摘要
NahR 是萘降解途径中响应水杨酸的转录调控因子，是检测萘和水杨酸的微生物生物传感器核心元件。为最大化传感器灵敏度，作者通过定点突变 nahR 基因进行理性设计，在已知参与中心诱导剂识别和 C 端多聚化的第 169 位和第 248 位构建 8 个单突变体（N169A、N169C、N169K、N169S、R248H、R248M、R248Q 和 R248Y）。突变效应通过监测 NahR 控制下荧光素酶（luc）报告基因的表达来评价。结果显示，248 位所有突变体以及 N169C 的灵敏度较野生型提高，最大约 50 倍；R248M 在通常具有毒性的 5 mM 浓度下仍显示响应。结果表明，突变策略可用于开发高灵敏、可拓展的微生物生物传感器。
英文摘要
NahR, a transcriptional regulator for naphthalene degradation in response to salicylate, is a central element in the microbial biosensor for detection of naphthalene and salicylate. To maximize the sensitivity of the biosensor, we have chosen a rational design of highly-sensitive microbial biosensors by introducing site directed mutagenesis to nahR gene. Eight single mutants (N169A, N169C, N169K, N169S, R248H, R248M, R248Q, and R248Y) were made at residues 169 and 248 known as the central inducer-recognition and the C-terminal multimerization domain. The effects of these mutations were examined by monitoring expression of a firefly luciferase (luc) reporter gene under the control of NahR. We found that all mutants at residues 248 and N169C show increased sensitivity (maximum ∼50-fold) compared to wild type, respectively. R248M shows response even at toxic concentration, 5mM. The results show the feasibility and potential versatility of mutational approach for the development of the highly-sensitive microbial biosensors.