组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
一氧化氮（NO）；样品基质：磷酸盐缓冲液（PBS）、大鼠肝匀浆上清、AGS 与 HT-29 癌细胞样品（含 L-Arg）
检测原理
NO 扩散至修饰电极表面后，被共价固定的微过氧化物酶（MP）血红素 Fe 中心识别并催化还原。MP 的 Fe(II)/Fe(III) 中心通过 MWCNT-PTTCA 导电网络与 AuNPs/GCE 之间发生直接电子转移，使 NO 在 −0.8 V 附近发生电催化还原，产生与 NO 浓度成正比的还原电流。MWCNT 与 PTTCA 纳米复合层提供高导电、大比表面积和羧基固定位点，AuNPs 进一步降低电子转移阻力，从而提高灵敏度。共固定的 SOD 将 O2− 歧化为 H2O2 和 O2，CAS 再将 H2O2 分解为 H2O 和 O2，从而在 NO 还原电位下消除主要还原性干扰物。最终由恒电位计时电流法读取电流信号，实现 NO 的定量检测。
检测灵敏度
LOD: 4.3 ± 0.2 nM；线性范围: 1.0–40 μM；线性方程: Ip (μA) = 1.65 (±0.2) + 1.20 (±0.01) [NO] (μM)；灵敏度斜率: 1.20 (±0.01) μA/μM；报告灵敏度: 1.10 ± 0.01 μA/μM；R^2 = 0.999
效应效果
该传感器选择性良好：2.0 μM NO 与 10 μM H2O2、10 μM O2−、1.0 mM 抗坏血酸、L-精氨酸、谷氨酸共存时无干扰。标准 NO 检测 RSD 为 1.7%，响应时间 3.60±0.03 s/μM。保存 1 个月后保留约 97% 初始响应，连续 20 次测量损失约 2.5%，5 个电极无显著差异。实际样品标准加入法测得大鼠肝 NO 3.82±0.83 μM（RSD 0.83，R^2=0.996），AGS 细胞 3.91±0.27 μM（RSD 0.27，R^2=0.994），HT-29 细胞 4.42±0.67 μM（RSD 0.67，R^2=0.999），与文献大鼠肝 1.3–2.5 μM、体内 1.3–6.3 μM 相符，可用于生物样品 NO 检测。
传感器的构成
- 基底电极：玻碳电极（GCE），抛光后作为工作电极与电子传导基底
- 纳米粒子层：金纳米粒子（AuNPs），由 HAuCl4 电沉积，粒径约 20 nm，增强电子转移与灵敏度
- 纳米复合层：羧基化多壁碳纳米管（MWCNT）与聚5,2′:5′,2′′-三联噻吩-3′-羧酸（PTTCA）电聚合形成的 MWCNT-PTTCA 层，提供导电固定基质和羧基位点
- 共价固定界面：EDC/NHS 活化 MWCNT-PTTCA 羧基，与酶氨基形成酰胺键
- 催化识别元件：微过氧化物酶（MP），含血红素 Fe 中心，催化 NO 电还原
- 抗干扰酶元件：超氧化物歧化酶（SOD），清除 O2− 干扰
- 抗干扰酶元件：过氧化氢酶（CAS），分解 H2O2 干扰
中文摘要
本文报道了一种高选择性一氧化氮（NO）生物传感器。将微过氧化物酶（MP）固定于多壁碳纳米管–聚5,2′:5′,2′′-三联噻吩-3′-羧酸（MWCNT-PTTCA）纳米复合层上，并共固定过氧化氢酶（CAS）和超氧化物歧化酶（SOD），以消除 H2O2 和 O2− 对 NO 检测的干扰。该纳米复合层可同时实现 CAS、SOD 和 MP 的直接电子转移，其氧化还原电位分别为 −0.11/+0.04、−0.33/−0.27 和 −0.47/−0.40 V（vs. Ag/AgCl）。在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子（AuNPs）以提高灵敏度。采用 SEM、XPS 和 QCM 对 CAS/SOD/MP/MWCNT-PTTCA/AuNPs 探针进行表征。该探针对 NO 的电催化还原表现出优异性能，主要归因于 MP 中的血红素基团。通过优化 pH、温度和应用电位，NO 的动态范围为 1.0–40 μM，检出限为 4.3±0.2 nM。进一步利用该传感器检测大鼠肝脏及人胃癌（AGS）和肠癌（HT-29）癌细胞释放的 NO，验证了其在真实生物样品中的应用可靠性。
英文摘要
A highly selective nitric oxide (NO) biosensor was developed by immobilizing microperoxidase (MP) onto the MWCNT-poly-5,2':5',2″-terthiophene-3'-carboxylic acid (PTTCA) nanocomposite. Catalase (CAS) and superoxide dismutase (SOD) co-immobilized on the probe successfully protected the interferences of H(2)O(2) and O(2)(-) during NO detection. The nanocomposite layer showed the direct electron transfer processes of the immobilized CAS, SOD, and MP simultaneously at -0.11/+0.04, -0.33/-0.27, and -0.47/-0.40 V vs. Ag/AgCl. Au nanoparticles (AuNPs) were electrodeposited on a glassy carbon surface to enhance the sensitivity of the sensor probe. The layers of CAS/SOD/MP/MWCNT-PTTCA/AuNPs were characterized using SEM, XPS, and QCM. The CAS/SOD/MP/MWCNT-PTTCA/AuNPs probe showed an excellent performance in the electrocatalytic reduction of NO which was attributed to the heme group of MP. Experimental conditions affecting the sensitivity of the biosensor were optimized in terms of pH, temperature, and applied potential. The dynamic range of NO analysis was from 1.0 to 40 μM with the detection limit of 4.3 ± 0.2 nM. The reliability of biosensor was examined for the determination of NO released from the real samples of rat liver, stomach (AGS), and intestinal (HT-29) cancer cells.