组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
N-乙酰-β-D-氨基己糖苷酶（NAGase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase），样品基质：巴氏杀菌牛奶/牛奶（加标牛奶）
检测原理
该传感器采用无标记SPR竞争抑制原理。首先用EDC/NHS活化CM5芯片表面，将纯化NAGase共价固定于芯片，形成固定抗原层。检测时，牛奶样品中的NAGase与抗NAGase scFv（J12）预孵育，形成scFv-NAGase复合物；随后将混合液注入芯片表面。样品中NAGase浓度越高，scFv被占用越多，能与固定NAGase结合的游离scFv越少，芯片表面结合质量越小，SPR响应（RU）越低。因此响应变化与NAGase浓度呈负相关。仪器实时监测反射光角度/折射率变化，通过空白标准差3倍确定检出限，无需酶标或荧光标记。
检测灵敏度
LOD: 1 μg/ml (10 U/L)；线性范围: 2.5–40 μg/ml (25–400 U/L)
效应效果
该SPR免疫分析可在巴氏杀菌牛奶复杂基质中检测NAGase，日内变异系数为3.63%–11.88%，日间为3.13%–11.17%，精密度良好。检出限为1 μg/ml（10 U/L），线性范围2.5–40 μg/ml（25–400 U/L）。与文献中丝网印刷碳电极电化学法相比，二者在牛奶/PBS中检出限相近（约10 U/L），但本方法线性范围更宽（25–400 U/L对3.1–108 U/L）。SPR法试剂用量少、抗体无标记、芯片可再生。健康牛奶NAGase约25 U/L，乳腺炎牛奶约30 U/L，均高于检出限，但区分健康与乳腺炎样品仍需进一步验证。
传感器的构成
- 基底/换能器：Biacore 3000 SPR芯片（CM5，羧甲基葡聚糖修饰金属膜/玻璃基底，提供表面等离子共振换能）
- 表面活化层：EDC/NHS活化CM5表面羧基，用于共价固定NAGase
- 固定抗原层：纯化牛脾NAGase固定于CM5表面，作为竞争抑制分析中的固定配体
- 封闭/再生层：乙醇胺封闭未反应NHS基团；10 mM NaOH再生表面
- 溶液识别元件：抗NAGase单链抗体scFv（J12，人源Tomlinson文库筛选，与样品中NAGase结合）
- 样品基质：巴氏杀菌牛奶，含加标NAGase
- 信号读出：无标记SPR响应（RU），结合质量变化反映NAGase浓度
中文摘要
牛乳腺炎是奶牛业重大挑战，早期诊断对降低产量损失、提高奶质和控制成本至关重要。N-乙酰-β-D-氨基己糖苷酶（NAGase）在乳腺炎症时释放入奶，可作为乳腺炎早期指标。本文从人源Tomlinson单链可变片段（scFv）抗体文库中筛选抗NAGase scFv，并将其用于自动化光学生物传感器免疫分析以检测牛奶中NAGase。经噬菌体展示四轮筛选、ELISA和抑制ELISA鉴定，获得高亲和克隆J12，并用尺寸排阻HPLC确认其以单体为主。将纯化NAGase固定于CM5芯片表面，在Biacore 3000表面等离子共振（SPR）平台上建立竞争抑制法：牛奶中NAGase与scFv预孵育后，scFv与芯片上固定NAGase的结合减少，SPR响应随NAGase浓度升高而降低。该法在加标牛奶中的检出限为1 μg/ml（10 U/L），线性范围为2.5–40 μg/ml（25–400 U/L），可用于乳腺炎早期筛查。
英文摘要
Bovine mastitis, an inflammation of the mammary gland in cows, is a major challenge for the dairy industry worldwide as it lowers milk yield, reduces milk quality and increases overall production costs. Early diagnosis is of the utmost importance. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) is an enzyme released into milk during inflammation and acts as an early indicator of mastitis. This paper describes the selection of anti-NAGase single chain fragment variable antibodies (scFv) from naïve human antibody libraries and their incorporation into an automated optical biosensor-based immunoassay to detect NAGase in milk. The scFv with the highest affinity for NAGase was first characterized by inhibition ELISA, followed by further evaluation using a surface plasmon resonance platform. Purified NAGase was immobilized on the surface of a CM5 chip and spiked NAGase milk samples were analyzed. The limit of detection for the assay for the assay was determined as 1μg/ml.