组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
小分子 GPCR 拮抗剂（β1AR 拮抗剂：propranolol、timolol、alprenolol、nebivolol、labetalol、ICI 118,551、clenbuterol、L-748,337、butoxamine、serotonin、atenolol、methylergonovine、ergonovine；A2AR 拮抗剂：ZM-241,385、PSB 36、XAC、SCH 442416、DPCPX、SCH 58261、MRS 1706、PSB 1115）；样品基质为含 DM 去垢剂与 DMSO 的 Tris–NaCl 运行缓冲液
检测原理
稳定化 His 标签 GPCR 先被 Ni2+-NTA 表面捕获，再经 EDC/sulfo-NHS 活化羧基共价交联，形成高密度且保持活性的受体表面。小分子拮抗剂注入后与受体结合，结合事件增加传感器表面质量并改变局部折射率，使表面等离子体共振条件发生偏移；Biacore 以共振单位（RU）记录结合与解离传感图。对高亲和力拮抗剂，结合/解离曲线按 1:1 模型全局拟合得到 ka、kd 和 KD；对低亲和力拮抗剂，平衡响应随浓度变化拟合 1:1 等温线。由于小分子质量低，方法依赖高活性受体表面和双参考校正；再生时以高浓度弱亲和力拮抗剂占据受体，被动置换已结合分析物。
检测灵敏度
—
效应效果
capture-coupling 固定表面在 24 h 内四次重复注入普萘洛尔完全重叠，而直接 NTA 捕获表面在同一时间段失去全部活性；capture-coupling 的普萘洛尔响应比直接捕获高 3 倍以上，Rmax 提示约 75% 受体保持活性。小分子拮抗剂结合响应重复性好，三次重复注入重叠良好，数据可拟合 1:1 模型。PSB 1115（100 μM）两次注入可置换 ZM-241,385，三个循环传感图重叠。方法可表征亲和力跨度超过 20,000 倍的小分子，低亲和力 β1AR 拮抗剂 KD 约 5–85 μM，作者认为其可用于 GPCR 药物发现与片段筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器：Biacore NTA 传感芯片（carboxymethylated dextran 预固定 NTA），提供 SPR 光学换能表面与配体固定基质
- 螯合修饰层：Ni2+ 负载 NTA，通过 His 标签捕获 β1AR* 或 A2AR*
- 化学偶联层：EDC/sulfo-NHS 活化羧基，实现 capture-coupling 共价交联
- 识别元件：稳定化 His10 标签 GPCR（β1AR* 或 A2AR*），保留小分子拮抗剂结合活性
- 运行介质：20 mM Tris–HCl（pH 7.8）、350 mM NaCl、0.1% DM 及 1% 或 5% DMSO，维持膜蛋白溶解与活性
- 再生元件：弱亲和力拮抗剂 L-748,337（β1AR*）或 PSB 1115（A2AR*），高浓度置换已结合分析物
中文摘要
本研究采用经点突变稳定化的β1肾上腺素受体（β1AR*）和人源A2A腺苷受体（A2AR*），利用Biacore表面等离子共振（SPR）生物传感器实时监测受体活性，并表征一系列小分子拮抗剂的结合常数，亲和力跨度超过20,000倍。作者进一步展示了一种改进的His标签受体固定方法：将受体先捕获于Ni2+负载的NTA（羧甲基葡聚糖预固定亚氨基二乙酸）芯片上，再用EDC/sulfo-NHS活化表面进行共价偶联，从而获得稳定、高容量且高活性的受体表面。研究还提出一种基于高浓度弱亲和力拮抗剂的置换再生策略，用于恢复受体结合位点。结果表明，稳定化GPCR与SPR生物传感器技术的结合能够高质量地解析GPCR与小分子配体的相互作用，有望成为表征该受体家族的常用方法。
英文摘要
Using stabilized forms of β₁ adrenergic and A₂(A) adenosine G-protein-coupled receptors, we applied Biacore to monitor receptor activity and characterize binding constants of small-molecule antagonists spanning more than 20,000-fold in affinity. We also illustrate an improved method for tethering His-tagged receptors on NTA (carboxymethylated dextran preimmobilized with nitrilotriacetic acid) chips to yield stable, high-capacity, high-activity surfaces as well as a novel approach to regenerate receptor binding sites. Based on our success with this approach, we expect that the combination of stabilized receptors with biosensor technology will become a common method for characterizing members of this receptor family.