组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
HA标签单链Fv抗体片段（HA-tagged scFv，细菌裂解液）、纯化单体抗原/分析物（purified monomeric analyte，HBS运行缓冲液）
检测原理
Biacore基于表面等离子共振（SPR）：光在金膜-液体界面发生全内反射时激发表面等离子体，SPR角对界面附近折射率变化敏感。CM5芯片的金膜上覆盖羧甲基葡聚糖（CM-dextran），其羧基经EDC/NHS活化为活性酯，与抗HA标签单克隆抗体（anti-HA mAb）的氨基共价偶联，再用乙醇胺封闭残余活化位点。HA标签scFv从细菌裂解液被anti-HA表面亲和捕获，形成可再生的识别层。当纯化单体分析物流过表面并与scFv结合时，表面质量增加引起局部折射率变化，导致SPR角偏移，仪器实时记录传感图。结合与解离速率随分析物浓度变化，经1:1模型拟合得到ka、kd和KD。该方法无标记、无酶放大，依靠亲和捕获提高识别元件密度和重复再生能力。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
方法强调试剂质量决定数据质量：分析物纯度>95%、完整且单体，裂解液加BSA和CM dextran降低非特异结合；参考表面与空白注入用于双参考，消除系统误差。通过再生筛选和表面性能测试维持基线与结合响应稳定，示例选择20 mM NaOH再生。重复/随机化注入评估重复性，但原文未报告RSD或实际样品回收率。示例动力学拟合给出ka=3.72×10^5 M−1s−1、kd=1.07×10−3 s−1、KD=2.88×10−9 M。作者主张可用于从粗细菌裂解液高通量筛选和排序数百scFv克隆，表达差异>1000倍；高容量anti-HA表面约10,000 RU，目标Rmax约50 RU，分析物浓度100–1.56 nM，并与KinExA、量热法比较显示Biacore数据可靠。
传感器的构成
- 基底/换能器：金膜（gold film）与CM5传感器芯片，提供SPR光学换能表面
- 修饰层：羧甲基葡聚糖（CM-dextran）水凝胶层，提供羧基用于EDC/NHS共价偶联
- 识别元件：抗HA标签单克隆抗体（anti-HA tag mAb），经EDC/NHS胺偶联固定，用于亲和捕获HA标签scFv
- 捕获识别元件：HA标签单链Fv抗体片段（HA-tagged scFv），从细菌裂解液捕获到anti-HA表面，作为抗原识别元件
- 封闭剂：1 M乙醇胺盐酸盐（ethanolamine-HCl, pH 8.5），封闭残余活化羧基并减少非共价吸附
- 运行基质：HBS运行缓冲液（10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% P20），维持蛋白稳定并降低非特异结合
- 再生剂：20 mM NaOH，洗脱结合的分析物并恢复表面
中文摘要
光学生物传感器用于研究大分子相互作用日益普及。仅2007年就有1179篇涉及生物传感器数据的论文，其数量与多样性使新用户难以积累和解读。本章旨在为读者提供准备、设计并高效执行Biacore动力学实验所需工具，引导用户理解基础理论、系统维护和检测设置，并提供实用技巧。许多基于动力学的筛选实验在分析前需要严格的样品制备和纯化。为突出这些步骤，本文协议描述采用抗体亲和捕获方法，从粗细菌裂解液中对单链Fv（scFv）抗体片段进行动力学表征。尽管具体流程是将HA标签scFv抗体片段捕获到抗HA标签单克隆抗体固定化表面后再进行动力学分析，但所述方法具有普遍适用性，可用于几乎任何亲和对和大多数Biacore系统。
英文摘要
The use of optical biosensors for studying macromolecular interactions is gaining increasing popularity. In one study, 1,179 papers that involved the application of biosensor data were identified for the year 2007 alone (Rich and Myszka, J Mol Recognit 21:355-400, 2008), the sheer volume and variety of which present a daunting task for the burgeoning biosensor user to accumulate and decipher. This chapter is designed to provide the reader with the tools necessary to prepare, design, and efficiently execute a kinetic experiment on Biacore. It is written to guide the Biacore user through basic theory, system maintenance, and assay set-up while also offering some practical tips that we find useful for Biacore-based studies. Many kinetic-based screening assays require rigorous sample preparation and purification prior to analysis. To highlight these procedures, this protocol describes the kinetic characterisation of single chain Fv (scFv) antibody fragments from crude bacterial lysates using an antibody affinity capture approach. Even though we specifically describe the capture of HA-tagged scFv antibody fragments to an anti-HA tag monoclonal antibody-immobilised surface prior to kinetic analysis, the same methodologies are universally applicable and can be used for practically any affinity pair and most Biacore systems.