组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
蛋白激酶A活性（protein kinase A activity, PKA activity）；样品基质：活体新生儿/成年心肌细胞肌浆网（sarcoplasmic reticulum, SR）
检测原理
SR-AKAR3由AKAR3与PLB跨膜域融合而成，锚定于心肌细胞肌浆网膜。PKA催化亚基识别并磷酸化AKAR3中的PKA底物序列，使AKAR3构象改变，缩短或改变CFP与YFP之间的相对距离和取向，从而增强FRET。检测时用420 nm激发，分别采集CFP（475 nm）和YFP（535 nm）发射，计算YFP/CFP比值。PKA活性升高时，磷酸化程度增加，FRET比值上升；PKA被H-89抑制或激动剂移除后，比值回落。肾上腺素能受体激活Gs-AC-cAMP通路，在SR微区提高cAMP并激活PKA，因此FRET比值随SR局部PKA活性动态变化。该FRET比值为内参比读出，无需外源标记放大。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率、相关系数。
效应效果
SR-AKAR3与SR标志物RyR2共定位。10 μM ISO使新生儿心肌细胞FRET比值快速升高，最大增幅0.31±0.03，达峰55.0±4.0 s（n=26）；forskolin最大增幅0.23±0.02，达峰93.0±2.8 s（n=35）；8-Br-cAMP最大增幅0.11±0.02，达峰100.0±11.7 s（n=44）；DMSO无变化。forskolin剂量反应EC50为130 nM（n=40）。β1/β2AR双敲除细胞中ISO无反应，forskolin仍有反应；H-89预处理使ISO响应降至0.07±0.01（n=30），加入H-89后FRET比值10 min内回落。SR-AKAR3磷酸化与内源PLB相当，不影响ISO诱导收缩率，说明选择性和生理相容性良好，可用于SR局部PKA动态及心衰研究。
传感器的构成
- 细胞定位基底：心肌细胞肌浆网（SR）膜，提供PKA信号微区与探针锚定位点。
- 膜锚定/靶向层：磷酸兰蛋白（PLB）跨膜螺旋域（PQQARQKLQNL-FINFCLILICLLLICIIVMLL）或突变域（SR-AFA），将探针靶向SR膜。
- 识别元件：A激酶活性生物传感器AKAR3，含PKA底物序列，被PKA磷酸化后改变构象。
- 荧光供体/换能器：青色荧光蛋白（CFP），作为FRET供体，发射由475DF40滤片收集。
- 荧光受体/换能器：黄色荧光蛋白（YFP），作为FRET受体，发射由535DF25滤片收集。
- 柔性连接子：SGGGGGS，连接突变PLB跨膜域与AKAR3，提高CFP/YFP运动灵活性。
- 表达递送载体：重组腺病毒（pAdTrack-CMV），用于心肌细胞中表达SR-AKAR3。
- 信号读出：双发射比荧光成像，420DF20激发、450DRLP二向色镜、CCD采集YFP/CFP比值。
中文摘要
第二信使cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）在多种细胞和生理反应中发挥重要作用。在心肌细胞肌浆网（SR）上，PKA调控兴奋–收缩耦联中的钙循环，其功能异常与心力衰竭等多种心脏病相关。本研究开发了一种新型基于荧光共振能量转移（FRET）的A激酶活性生物传感器SR-AKAR3，用于直接可视化SR上的PKA动态。肾上腺素能受体激活可诱导SR-AKAR3 FRET比值快速且显著升高，该反应依赖于受体激动剂占据，并可被PKA抑制剂H-89抑制。相比之下，直接激活腺苷酸环化酶或施加cAMP类似物8-Br-cAMP仅引起更慢且更小的FRET比值升高。这些结果表明，肾上腺素能刺激诱导的信号相较于直接激活腺苷酸环化酶具有优先到达SR的特性。此外，SR-AKAR3在肾上腺素能刺激下可模拟SR内源磷酸兰蛋白（PLB）的PKA介导磷酸化及心肌收缩反应。该新型PKA活性生物传感器为在不同生理和临床条件下直接观察心肌细胞SR上PKA活性的动态调控提供了有用工具。
英文摘要
The second messenger cAMP-dependent protein kinase A (PKA) plays an important role in the various cellular and physiological responses. On the sarcoplasmic reticulum (SR) in cardiomyocytes, PKA regulates the calcium cycling for exciting-contraction coupling, which is often dysfunctional in a variety of heart diseases including heart failure. Here, we have developed a novel FRET-based A-kinase activity biosensor (AKAR), termed SR-AKAR3, to visualize the PKA dynamics on the SR. Activation of adrenergic receptor induces a rapid and significant increase in SR-AKAR3 FRET ratio, which is dependent on agonist occupation of the receptor and inhibited by H-89, a PKA inhibitor. Interestingly, direct activation of adenylyl cyclases or application of a cAMP analog 8-Br-cAMP induced much slower and smaller increases in SR-AKAR3 FRET ratio. These data indicate that the signaling induced by adrenergic stimulation displays a preferential access to the SR in comparison to those by direct activation of adenylyl cyclases. More, SR-AKAR3 mimics endogenous protein phospholamban on the SR for PKA-mediated phosphorylation and myocyte contraction response under adrenergic stimulation. Together, this new PKA activity biosensor provides a useful tool to directly visualize the dynamic regulation of PKA activity on the SR in cardiomyocytes under various physiological and clinical conditions.