组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
肉毒神经毒素B（botulinum neurotoxin B, BoNT/B，含全毒素与轻链活性）；样品基质：液态食品（胡萝卜汁、苹果汁、奶粉、脱脂牛奶）和人类血清
检测原理
CM3 SPR芯片上先共价固定兔抗小鼠Fc抗体，再捕获抗VAMP2单抗、抗突触素单抗和非免疫IgG。大鼠脑10,000 g上清SnH中的突触囊泡流过芯片并被抗体捕获。样品中BoNT/B在DTT还原二硫键后，其轻链锌内肽酶切割囊泡膜蛋白VAMP2的Q76-F77肽键，使抗VAMP2抗体可识别的N端表位丢失；抗突触素通道不受影响，非免疫IgG用于扣除非特异结合。Biacore 3000实时监测SPR响应单位RU，抗VAMP2通道结合量随BoNT/B浓度和作用时间下降，并以抗突触素信号归一化。血清样品可先用抗BoNT/B-Hc抗体蛋白A琼脂糖珠免疫沉淀富集毒素，再与SnH孵育，从而提高检测灵敏度。
检测灵敏度
LOD/检测阈值（20% VAMP2切割）: 胡萝卜汁 0.3 ± 0.06 pM、苹果汁 0.3 ± 0.1 pM、奶粉 2 ± 1 pM、脱脂牛奶 5 ± 3 pM（2–37 LD50/ml）；血清免疫沉淀后检测限: 0.01 LD50/ml（4–5 h）；EC50: 缓冲液 0.04 ± 0.007 pM，冷冻SnH 1.4 ± 0.5 pM，冻干SnH 1.7 ± 0.6 pM，胡萝卜汁 2 ± 0.9 pM，苹果汁 4 ± 0.7 pM，奶粉 8 ± 4 pM，脱脂牛奶 20 ± 8 pM，10%血清 1.2 ± 0.2 pM；0 mM NaCl 2 pM，100 mM NaCl 107 pM，400 mM NaCl 3.7 nM；2 pM天然BoNT/B全毒素10 min内检出，10 pM BoNT/B-Lc 2 min内检出。
效应效果
该方法在低离子强度缓冲液中有效，pH 5.5–9.0稳定；冻干SnH至少稳定2年，数据点误差通常小于10%。液态食品中低皮摩尔BoNT/B可在3 h内检出；血清经抗BoNT/B-Hc免疫沉淀后，0.1 LD50/ml可检出28%切割，0.01 LD50/ml在4–5 h检出，较既往免疫捕获法提高约50–100倍。16例B型肉毒中毒患者血清均阳性，20例健康对照VAMP2保持100±3.7%，LEMS和GBS血清阴性。相比小鼠生物测定（2–20 pg/ml，24–48 h），本方法10 min可测2 pM（15 LD50/ml），可用于食品安全与临床诊断。
传感器的构成
- 换能器/基底：CM3 SPR传感芯片（表面等离子共振换能器）
- 固定化层：胺偶联试剂盒将兔抗小鼠Fc多克隆抗体共价固定于CM3芯片
- 识别/捕获层：抗VAMP2单克隆抗体Cl 69.1捕获含VAMP2的突触囊泡
- 内参/参考层：抗突触素单克隆抗体Cl 7.2作为内参，非免疫IgG作为参考通道
- 底物/识别事件层：大鼠脑10,000 g上清SnH中的突触囊泡，VAMP2为BoNT/B天然底物
- 信号读出：Biacore 3000 SPR仪无标记实时监测抗体-囊泡结合变化，以响应单位RU表示
中文摘要
肉毒神经毒素（BoNTs）是已知毒性最强的物质之一，食品与血清中快速检测 BoNTs 对监测和诊断至关重要。本研究建立了一种在数分钟时间尺度上特异性检测肉毒神经毒素B（BoNT/B）蛋白酶活性的体外无标记检测方法。以突触囊泡膜蛋白 VAMP2 为天然底物，利用实时表面等离子共振（SPR）监测特异性抗体芯片对囊泡的捕获。该体系在低离子强度缓冲液中有效，并在 pH 5.5–9.0 范围内稳定。10 min 内可检出 2 pM 天然 BoNT/B 全毒素；胡萝卜汁、苹果汁和牛奶等液态食品中低皮摩尔水平 BoNT/B 污染可在 3 h 内被揭示。B型肉毒中毒患者血清中可检出 BoNT/B 活性，而健康对照及其他神经系统疾病患者血清为阴性。该蛋白芯片方法稳健、灵敏、快速，适用于食品监测和B型肉毒中毒诊断，有望替代现有小鼠体内生物测定。
英文摘要
Botulinum neurotoxins (BoNTs) are among the most toxic substances known. Surveillance and diagnostics require methods for rapid detection of BoNTs in complex media such as foodstuffs and human serum. We have developed in vitro assays to specifically detect the protease activity of botulinum neurotoxin B (BoNT/B) on a time scale of minutes. Cleavage of the BoNT/B substrate VAMP2, a membrane SNARE protein associated with synaptic vesicles, was monitored using real-time surface plasmon resonance to measure vesicle capture by specific antibodies coupled to microchips. The assay is functional in low-ionic-strength buffers and stable over a wide range of pH values (5.5-9.0). Endoproteolytic cleavage of VAMP2 was detected in 10 min with 2 pM native BoNT/B holotoxin. Contamination of liquid food products such as carrot juice, apple juice, and milk with low picomolar amounts of BoNT/B was revealed within 3h. BoNT/B activity was detected in sera from patients with type B botulism but not in healthy controls or patients with other neurological diseases. This robust, sensitive, and rapid protein chip assay is appropriate for monitoring BoNT/B in food products and diagnostic tests for type B botulism and could replace the current in vivo mouse bioassay.