组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
其他（光学生物传感器）
检测对象
表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG），样品基质为 PBS/PBS-T 缓冲液（非生物样品）
检测原理
CMD 表面经 EDC/NHS 活化后，通过羧基与氨基共价固定 HMGR，形成识别层。溶液中的 EGCG 扩散至传感表面，与 HMGR 的 NADPH 辅因子位点竞争性结合。结合事件使表面质量/折射率发生变化，IAsys plus 共振镜光学系统将其转换为相位或响应值（arcsec）的实时变化。EGCG 浓度越高，平衡结合量越大，响应越强；解离时加入 PBS 使响应回落。通过单指数结合/解离动力学拟合得到 kass、kdiss 和 KD。NADPH 预饱和可消除 EGCG 响应，证明其结合位点与辅因子位点重叠，无信号放大。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
光学生物传感器固定 HMGR 的响应为 800 arcsec，相当于 90 kDa 蛋白部分单层（1.30 ng/mm2）。表面在至少 50 次结合/解离循环后仍保持稳定性和酶活性。EGCG 与 HMGR 的 KD 为 88.8±31.4 nM，kass=29,500±2,900 M-1 s-1，kdiss=(2.6±0.9)×10^-3 s-1；平衡 KD 为 98.9±23.8 nM。NADPH 预饱和可消除 EGCG 结合，HMG-CoA 预饱和不影响，显示辅因子位点选择性。G807D 突变使 EGCG 结合 Kd,app 升高至少 400 倍。EGCG 与普伐他汀联用呈协同抑制，普伐他汀亲和力由 10^8 M-1 降至 0.47×10^8 M-1。
传感器的构成
- 基底/换能器：CMD 比色皿（carboxymethyl-dextran, CMD）表面，作为光学传感表面并提供羧基用于固定
- 活化层：EDC/NHS（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide / N-hydroxysuccinimide）活化 CMD 羧基，形成活性酯
- 识别元件：HMG-CoA reductase（HMGR）固定于 CMD 表面，作为结合 EGCG 的识别元件
- 封闭剂：1 M ethanolamine（pH 8.5）封闭未反应羧基，减少非特异结合
- 缓冲/洗脱层：PBS-T（10 mM Na2HPO4、2.7 mM KCl、138 mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.4）用于平衡与洗涤；PBS（pH 7.4）用于解离
- 读出系统：IAsys plus 光学生物传感器与 Fast Fit 软件，监测结合/解离响应（arcsec）
中文摘要
羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是胆固醇合成的限速酶，因其在降胆固醇药物开发中的重要性，研究者已筛选多种可调节其活性的化合物。多酚提取物常作为他汀类药物的替代或辅助降胆固醇手段，但其作用机制尚未完全阐明。本研究对绿茶中含量最高的儿茶素表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）调节 HMGR 的机制进行了详细的动力学与平衡研究。通过光谱法、光学生物传感器、色谱分析、分子对接以及 HMGR 辅因子位点定点突变相结合的方法，证明 EGCG 可在体外强效抑制 HMGR 活性（Ki 达纳摩尔水平），其机制为竞争性结合还原酶的辅因子位点。最后，作者还评估了 EGCG 与他汀类药物联合使用的效应。
英文摘要
Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGR) is the rate-controlling enzyme of cholesterol synthesis, and owing to its biological and pharmacological relevance, researchers have investigated several compounds capable of modulating its activity with the hope of developing new hypocholesterolemic drugs. In particular, polyphenol-rich extracts were extensively tested for their cholesterol-lowering effect as alternatives, or adjuvants, to the conventional statin therapies, but a full understanding of the mechanism of their action has yet to be reached. Our work reports on a detailed kinetic and equilibrium study on the modulation of HMGR by the most-abundant catechin in green tea, epigallocatechin-3-gallate (EGCG). Using a concerted approach involving spectrophotometric, optical biosensor, and chromatographic analyses, molecular docking, and site-directed mutagenesis on the cofactor site of HMGR, we have demonstrated that EGCG potently inhibits the in vitro activity of HMGR (K(i) in the nanomolar range) by competitively binding to the cofactor site of the reductase. Finally, we evaluated the effect of combined EGCG-statin administration.