组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
环磷酸腺苷（cAMP）；样品基质：完整小鼠胰岛（intact mouse pancreatic islets）及 MIN6 β 细胞
检测原理
腺病毒将 cAMP 转位生物传感器导入完整胰岛细胞或 MIN6 细胞。传感器由膜锚定 RIIb-CFP-CAAX 和胞质 Ca-YFP 组成：基础状态下 Ca-YFP 与 RIIb 结合，CFP/YFP 荧光比值低；当葡萄糖、胰高血糖素或 GLP-1 激活跨膜腺苷酸环化酶（tmAC）使 cAMP 升高时，cAMP 结合 RIIb，促使 Ca-YFP 从质膜附近解离，CFP 与 YFP 距离改变，CFP/YFP 比值升高。TIRF 显微镜以 488 nm 光激发近膜区域，EMCCD 相机采集 CFP 和 YFP 荧光，MetaFluor 计算背景校正比值并归一化，从而实时反映 [cAMP]pm 的升高或振荡。Ca2+ 可通过钙调蛋白敏感腺苷酸环化酶放大 cAMP 信号，但去除 Ca2+ 后振荡仍可维持，说明 cAMP 振荡并非完全依赖 Ca2+。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该荧光转位生物传感器在完整小鼠胰岛中记录 α 和 β 细胞质膜下 cAMP 动力学。GLP-1 0.5–10 nmol/L 诱导 β 细胞振荡，频率 0.18–2.1 min^-1，幅度 0.06–1.5 归一化比值单位；>50 nmol/L 持续升高。胰高血糖素和 GLP-1 半最大效应约 80 和 30 nmol/L，最大效应约 1000 和 300 nmol/L。葡萄糖 11–30 mmol/L 诱导慢振荡，频率 0.05–0.4/min，幅度 0.05–0.6 比值单位。β 细胞间同步。DDA 抑制葡萄糖和激素诱导的 cAMP 升高，KH7 干扰葡萄糖氧化，CE 无持续效应；去除 Ca2+ 后振荡仍持续。应用价值：揭示完整胰岛 cAMP 信号与脉冲激素分泌调控。
传感器的构成
- 基底/支撑层：多聚赖氨酸涂层盖玻片（poly-L-lysine-coated coverslip），固定完整胰岛并作为 TIRF 成像界面
- 细胞表达层：完整小鼠胰岛（intact mouse pancreatic islets）或 MIN6 β 细胞，表达 cAMP 转位生物传感器并维持 α/β 细胞信号环境
- 识别元件：膜锚定 cAMP 结合蛋白 RIIb-CFP-CAAX（PKA 调节亚基 RIIb 融合 CFP 并 CAAX 膜锚定），特异性结合 cAMP
- 信号报告元件：PKA 催化亚基 Ca-YFP（catalytic α subunit fused to YFP），cAMP 结合后与 RIIb 解离并改变 CFP/YFP 荧光比值
- 表达载体：腺病毒（adenovirus），将 cAMP 转位生物传感器基因导入胰岛细胞或 MIN6 细胞
- 换能/读出层：TIRF 显微镜（Eclipse Ti，60× 1.45 NA）、488 nm 激发、EMCCD 相机（DU-887）与 MetaFluor 软件，输出背景校正 CFP/YFP 比值
中文摘要
cAMP 是调控胰岛 β 细胞胰岛素和 α 细胞胰高血糖素分泌的关键第二信使。分散 β 细胞可出现 cAMP 振荡，但完整胰岛内信号动力学尚不清楚。本研究利用全内反射显微镜（TIRF）和荧光转位生物传感器，记录完整小鼠胰岛外周 α 和 β 细胞质膜下 cAMP 浓度（[cAMP]pm），并依据肾上腺素的相反作用鉴定细胞类型。结果显示，3 mmol/L 葡萄糖中 [cAMP]pm 低而稳定；胰高血糖素和 GLP-1 诱导剂量依赖性升高，常伴随 β 细胞间同步振荡；胰高血糖素也诱导多数 α 细胞振荡，而仅少数 α 细胞对 GLP-1 有反应。葡萄糖升至 11–30 mmol/L 可在无激素条件下诱导 α 和 β 细胞慢速 cAMP 振荡。β 细胞中 cAMP 振荡与胞质 Ca2+ 振荡协调，但并非由 Ca2+ 变化引起。跨膜腺苷酸环化酶抑制剂 DDA 抑制葡萄糖和激素诱导的 cAMP 升高，可溶性腺苷酸环化酶抑制剂 KH7 和 CE 分别干扰代谢或无效。结论：完整胰岛中受刺激 β 细胞振荡性 cAMP 信号依赖跨膜腺苷酸环化酶；α 细胞中葡萄糖和胰高血糖素诱导的 cAMP 振荡提示其参与脉冲式胰高血糖素分泌。
英文摘要
OBJECTIVE: cAMP is a critical messenger for insulin and glucagon secretion from pancreatic β- and α-cells, respectively. Dispersed β-cells show cAMP oscillations, but the signaling kinetics in cells within intact islets of Langerhans is unknown.
RESEARCH DESIGN AND METHODS: The subplasma-membrane cAMP concentration ([cAMP](pm)) was recorded in α- and β-cells in the mantle of intact mouse pancreatic islets using total internal reflection microscopy and a fluorescent translocation biosensor. Cell identification was based on the opposite effects of adrenaline on cAMP in α- and β-cells.
RESULTS: In islets exposed to 3 mmol/L glucose, [cAMP](pm) was low and stable. Glucagon and glucagon-like peptide-1(7-36)-amide (GLP-1) induced dose-dependent elevation of [cAMP](pm), often with oscillations synchronized among β-cells. Whereas glucagon also induced [cAMP](pm) oscillations in most α-cells, <20% of the α-cells responded to GLP-1. Elevation of the glucose concentration to 11-30 mmol/L in the absence of hormones induced slow [cAMP](pm) oscillations in both α- and β-cells. These cAMP oscillations were coordinated with those of the cytoplasmic Ca(2+) concentration ([Ca(2+)](i)) in the β-cells but not caused by the changes in [Ca(2+)](i). The transmembrane adenylyl cyclase (AC) inhibitor 2'5'-dideoxyadenosine suppressed the glucose- and hormone-induced [cAMP](pm) elevations, whereas the preferential inhibitors of soluble AC, KH7, and 1,3,5(10)-estratrien-2,3,17-β-triol perturbed cell metabolism and lacked effect, respectively.
CONCLUSIONS: Oscillatory [cAMP](pm) signaling in secretagogue-stimulated β-cells is maintained within intact islets and depends on transmembrane AC activity. The discovery of glucose- and glucagon-induced [cAMP](pm) oscillations in α-cells indicates the involvement of cAMP in the regulation of pulsatile glucagon secretion.