组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）酶活性；样品基质：体外蛋白酶缓冲液、HeLa 细胞、HT1080 细胞
检测原理
该传感器为 ECFP-肽底物-YPet 融合蛋白。活性 MT1-MMP 识别并切割中间肽底物，使 ECFP 与 YPet 永久分离，FRET 消失。切割前，ECFP 作为供体将能量非辐射转移至 YPet，ECFP 平均寿命由 2.84 ns 降至 0.70 ns，FRET 效率约 0.75；YPet 的相位延迟和调制比也随 FRET 改变。频域 FLIM 用 440 nm 调制激光激发，测量荧光相位延迟与调制比。相位差分增强选择两个检测相位图像相减，放大完整态与切割态之间的小相位差，只需两幅相位图即可快速成像。MT1-MMP 活性越高，被切割传感器越多，ECFP 通道寿命/相位向自由 ECFP 移动，YPet 通道向直接激发 YPet 移动，差分强度随之改变。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
选择性通过 MT1-MMP 特异性底物和抑制剂 GM6001 验证：HeLa 共表达 MT1-MMP 后传感器被切割，单表达保持完整；HT1080 加 GM6001 后主要保持完整态。细胞自荧光和未配对 ECFP 使 ECFP 通道变化较小，YPet 通道更可靠。HeLa ECFP 通道各相位强度标准偏差小于 2%，HT1080 YPet 通道小于 4%。相位差分增强使 HeLa 两组细胞强度差约一个数量级，完整态与切割态归一化强度差约 3 倍；HT1080 YPet 通道相位差约 3.7°，差分后两组强度差约 2 倍。相比直接极坐标图或迭代寿命拟合，该方法增强小相位差并只需两幅相位图，适合快速活细胞成像，用于研究肿瘤侵袭中 MT1-MMP 的时空活性。
传感器的构成
- 基底/换能层：无传统电极，ECFP/YPet 荧光蛋白对通过 FRET 将酶切事件转换为荧光寿命/相位变化
- 传感蛋白骨架：ECFP-底物-YPet 融合蛋白，N端 His6 标签，大肠杆菌表达并镍螯合纯化
- 识别元件：MT1-MMP 催化域特异性底物，插入 ECFP 与 YPet 之间，被活性 MT1-MMP 切割
- 供体荧光标记：ECFP（enhanced cyan fluorescent protein），440 nm 激发、460–500 nm 发射
- 受体荧光标记：YPet（yellow fluorescent protein for FRET），510–565 nm 发射
- 样品基质：HeLa/HT1080 活细胞，转染融合蛋白；HT1080 可用 GM6001 抑制 MT1-MMP
- 读出平台：同相全场频域 FLIM 显微镜，440 nm 调制激光（40/80 MHz）、图像增强器、ECFP/YPet 滤光片
- 校准物：fluorescein（荧光素，0.1 N NaOH，寿命 4.3 ns），用于频域 FLIM 校准
中文摘要
荧光寿命分辨成像显微镜（FLIM）已被用于监测蛋白水解酶膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）的酶活性，该酶参与细胞外基质蛋白降解及细胞迁移等过程，其表达升高与肿瘤细胞侵袭潜能正相关。本文利用一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器，在体外及活 HeLa 和 HT1080 细胞中检测 MT1-MMP 的分子活性。活细胞成像采用全场频域 FLIM，图像分析结合极坐标图与相位差分增强。相位差分增强类似于相位抑制，可在两种构象的荧光寿命差异较小时，提高 MT1-MMP 生物传感器完整态与切割态之间的区分度。该方法只需采集两幅相位图像，即可快速成像活细胞中 MT1-MMP 的活性变化，为研究肿瘤侵袭中 MT1-MMP 的时空激活模式提供工具。
英文摘要
Fluorescence lifetime-resolved imaging microscopy (FLIM) has been used to monitor the enzymatic activity of a proteolytic enzyme, Membrane Type 1 Matrix Metalloproteinase (MT1-MMP), with a recently developed FRET-based biosensor in vitro and in live HeLa and HT1080 cells. MT1-MMP is a collagenaise that is involved in the destruction of extra-cellular matrix (ECM) proteins, as well as in various cellular functions including migration. The increased expression of MT1-MMP has been positively correlated with the invasive potential of tumor cells. However, the precise spatiotemporal activation patterns of MT1-MMP in live cells are still not well-established. The activity of MT1-MMP was examined with our biosensor in live cells. Imaging of live cells was performed with full-field frequency-domain FLIM. Image analysis was carried out both with polar plots and phase differential enhancement. Phase differential enhancement, which is similar to phase suppression, is shown to facilitate the differentiation between different conformations of the MT1-MMP biosensor in live cells when the lifetime differences are small. FLIM carried out in differential enhancement or phase suppression modes, requires only two acquired phase images, and permits rapid imaging of the activity of MT1-MMP in live cells.