组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
鸡卵白溶菌酶（hen egg-white lysozyme, HEL）、大肠杆菌 MalE 蛋白（MalE）；样品基质为 Buffer C（150 mM NaCl、50 mM Tris–HCl，pH 7.4）或 ≤50% 小牛血清与 Buffer C 混合
检测原理
该传感器将抗原结合蛋白（AgBP）与溶剂致变色荧光团 IANBD 整合为单一分子。首先把 AgBP 超变区中对结合贡献较小的残基突变为 Cys，再与 IANBD 酯发生硫醚化偶联。游离态下荧光团暴露于水相，荧光较弱且可被 KI 猝灭；当 HEL 或 MalE 与 AgBP 形成 1:1 复合物时，结合界面使邻近荧光团被屏蔽，局部极性降低，溶剂致变色荧光增强。荧光变化 ΔF/F0 与复合物占比 [B:A]/[B]0 成正比，低抗原浓度下满足 ΔF/F0=sr[A]0/[B]0，其中 sr 由最大荧光变化 ΔF∞/F0 和解离常数 Kd 决定。因此无需外加标记或试剂，直接通过荧光强度即可定量抗原浓度。
检测灵敏度
LOD: 0.68 nM（H4S(K24ANBD)，[B]0=0.3 μM，基于仪器可检测 ΔF/F0=1.5%）；LOD: 4.3 nM（MBP3 16(K89ANBD)，[B]0=1.0 μM）；相对灵敏度 sr: 6.61（H4S(K24ANBD)）；sr: 3.46（MBP3 16(K89ANBD)）；拟合 Pearson R > 0.992（多数 H4S 偶联物，Phe7 R=0.98，Trp22 R=0.72）
效应效果
H4S(K24ANBD) 对 HEL 的 sr 为 6.61，而对非靶 BSA 的 Kd=1.0±0.3 μM、ΔF∞/F0=0.26±0.01，sr 比 HEL 低 106 倍，显示高特异性。该偶联物在 ≤50% 小牛血清中仍可工作，但血清吸收使荧光响应低于缓冲液；对照 2-巯基乙醇-IANBD 显示部分血清成分可干扰游离荧光团。KI 猝灭实验中，自由态与 HEL 结合态的 Stern–Volmer 常数分别为 6.7±0.1 M−1 和 2.5±0.1 M−1，支持结合后荧光团被屏蔽。H4S 与 MBP3 16 偶联产率分别为 72±3% 和 97±1%，合成产率 65±3% 和 71±2%。作者认为其可用于即时、定量、无试剂检测，适合微型低成本光学装置。
传感器的构成
- 反应体系：溶液相无固定基底，AgBP-IANBD 偶联物直接溶于 Buffer C 或 ≤50% 小牛血清中
- 识别元件：DARPin MBP3 16 或 Nanofitin H4S（AgBP），提供对 MalE 或 HEL 的特异性结合位点
- 偶联位点：位点定向突变引入的 Cys，位于超变区非关键残基，用于共价连接荧光团
- 信号标记物：IANBD 酯（N-((2-(iodoacetoxy)ethyl)-N-methyl)amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole），溶剂致变色荧光团，结合后微环境屏蔽导致荧光增强
- 读出装置：FP-6300 荧光分光光度计，485 nm 激发、520–550 nm 发射检测
中文摘要
抗体和人工抗原结合蛋白（AgBP）家族均由恒定多肽骨架支撑的一组超变（或随机化）残基位点构成，特定抗原的结合位点由这些超变残基中的部分残基形成。本文证明，可将这些家族中的任意 AgBP 转化为针对目标抗原的无试剂荧光生物传感器：先通过位点定向突变将某个对抗原结合贡献很小或不重要的超变残基突变为半胱氨酸，再将溶剂致变色荧光团偶联到该突变半胱氨酸上。当抗原结合时，荧光团被结合界面屏蔽，局部微环境改变，从而引起可测量的荧光变化。作者以 DARPin（MBP3 16，识别 MalE）和 Nanofitin（H4S，识别鸡卵白溶菌酶 HEL）验证了该策略，并获得了较高成功率。所得无试剂荧光生物传感器可即时、定量、选择性和特异性地识别抗原，无需对样品进行前处理或额外添加试剂。
英文摘要
Antibodies and artificial families of antigen binding proteins (AgBP) are constituted by a connected set of hypervariable (or randomized) residue positions, supported by a constant polypeptide backbone. The residues that form the binding site for a given antigen, are selected among the hypervariable residues. We showed that it is possible to transform any AgBP of these families into a reagentless fluorescent biosensor, specific of the target antigen, simply by coupling a solvatochromic fluorophore to one of the hypervariable residues that have little or no importance for the interaction with the antigen, after changing this residue into cysteine by mutagenesis. We validated this approach with a DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) and a Nanofitin (also known as Affitin) with high success rates. Reagentless fluorescent biosensors recognize their antigen in an immediate, quantitative, selective and specific way, without any manipulation of the sample to analyze or addition of reagent.