组成图示
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传感器类型
微流控生物传感器
检测对象
β-半乳糖苷酶（β-Gal）酶活性；样品基质：细胞裂解液或低体积低浓度样品（PBS/MgCl2缓冲液）
检测原理
该芯片利用Nafion膜在微/纳通道界面形成离子浓度极化，产生电场梯度，将带负电的酶和荧光底物从较大体积样品中浓缩到皮升级液塞。酶与底物在液塞内发生Michaelis–Menten催化反应，荧光底物FDG或RDG被β-Gal水解为荧光素或罗丹明类产物，荧光强度随产物累积增强。非线性模式中酶与底物同时累积并反应，初始为酶限制二次方增长，后期转为底物限制线性增长；线性模式仅浓缩酶后与固定量底物在封闭皮升级反应室混合，反应速率随酶浓度线性增强。信号由荧光显微镜成像读出，实现低丰度酶活性的放大检测。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
非线性模式中，五通道多路复用实验显示初始反应速率与酶浓度线性相关，施加浓缩电压后速率增强约400倍；后期进入底物限制线性阶段，有助于降低裂解液中传感底物与脱靶酶的非特异反应。线性模式中，仅浓缩酶并与固定量底物混合，初始产物生成速率提高约50倍；酶累积20分钟时速率增强约73倍，三次重复实验初始率变化小。封闭反应室产物曲线符合Michaelis–Menten模型，KM约12 mM、vMAX约6.9×10^-2 mM s^-1，与文献范围一致。当前限制是浓缩塞转移扩散导致增强下降，但可用于低丰度酶检测与抑制剂研究。
传感器的构成
- 基底/微流控层：PDMS（Sylgard 184）双层软刻蚀微通道与气动阀，承载浓缩区、混合区与皮升级反应室。
- 浓缩膜：Nafion膜图案化于玻璃片，形成离子浓度极化电场梯度，浓缩带电酶与底物。
- 电极：铂电极浸入输入/输出储液池，施加10–25 V驱动浓缩。
- 表面封闭层：1% BSA涂覆通道表面，降低非特异蛋白吸附。
- 催化酶（被测物）：β-半乳糖苷酶（β-Gal，E. coli），催化荧光底物水解。
- 信号底物：FDG或RDG，被β-Gal水解生成荧光素或罗丹明类荧光产物。
- 示踪标记：BPE或Alexa-488-BSA标记酶流，用于观察浓缩塞位置。
- 读出系统：倒置荧光显微镜IX71、LED光源与CCD相机，采集荧光强度。
中文摘要
本研究在纳流体生物分子浓缩芯片中考察浓度增强型酶活性检测，用于从细胞裂解液及其他低体积、低浓度样品中检测和研究极低丰度酶。作者建立了一种操作模式的数学模型：酶与底物被共同浓缩到芯片上的液塞中，导致反应速率非线性增强。模型预测并实验验证了两个反应阶段：初始二次方酶限制阶段和后期线性底物限制阶段。结果表明，在多数实际情况下反应最终进入底物限制阶段，从而降低传感底物与脱靶酶发生非特异反应的担忧。作者还利用该模式演示了多路复用浓度增强酶活性检测。随后提出并演示了新装置与操作模式：仅浓缩酶，再与相邻皮升级反应室中固定量底物混合，实现反应速率线性增强，可用于浓缩低丰度酶后进行机理研究。
英文摘要
In this work we investigate concentration-enhanced enzyme activity assays in nanofluidic biomolecule concentrator chips which can be used to detect and study very low abundance enzymes from cell lysates and other low volume, low concentration samples. A mathematical model is developed for a mode of operation of the assay (J. H. Lee, B. D. Cosgrove, D. A. Lauffenburger and J. Han, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 10340-10341) in which enzyme and substrate are concentrated together into a plug on chip which results in a non-linear enhancement of the reaction rate. Two reaction phases, an initial quadratic enzyme-limited phase and a later, linear substrate-limited phase, are predicted and then verified with experiments. It is determined that, in most practical situations, the reaction eventually enters a substrate-limited phase, therefore mitigating the concern for non-specific reactions of biosensor substrates with off-target enzymes in such assays. We also use this mode to demonstrate a multiplexed concentration-enhanced enzyme activity assay. We then propose and demonstrate a new device and mode of operation, in which only the enzyme is concentrated and then mixed with a fixed amount of substrate in an adjacent picolitre-scale reaction chamber. This mode results in a linear enhancement of the reaction rate and can be used to perform mechanistic studies on low abundance enzymes after concentrating them into a plug on chip.