组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
胞内cAMP（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）；样品基质：HEK293细胞、原代纹状体神经元、纹状体脑片。
检测原理
多巴胺（DA）或D1选择性激动剂SKF81297结合细胞膜D1受体后，受体构象改变并激活Gs/Golf；Gα亚基进一步激活腺苷酸环化酶V（ACV），将ATP转化为cAMP，使胞内cAMP浓度升高。cAMP结合Epac1-cAMPs FRET生物传感器的Epac1 cAMP结合域，引起CFP-YFP相对构象变化，降低FRET效率，表现为YFP/CFP发射比值下降。宽场或TIRF荧光显微镜实时采集双通道荧光，归一化FRET比值随cAMP浓度升高而下降，从而反映D1受体激活强度。论文进一步显示，D1受体激活后快速经网格蛋白包被小窝内吞，进入早期内体膜并与Gs/Golf、ACV接近，产生第二波cAMP；抑制内吞降低急性cAMP，而抑制回收不影响，说明信号放大来自内吞途径中的受体-下游信号分子接近，而非受体再循环。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2。
效应效果
未报告LOD、线性范围、RSD或加标回收率，也未与ELISA/HPLC/qPCR对比。选择性上，dynasore抑制内吞后D1受体介导cAMP下降，但不影响forskolin激活腺苷酸环化酶产生的cAMP，也不改变脑片基础放电。重现性上，n=5–31，dynasore、clathrin siRNA和360–382缺失突变均削弱急性cAMP。回收实验显示89.4±1.8%内化FD1R在洗脱后5分钟返回膜表面，但EHD3敲低或bafilomycin A1抑制回收不影响急性cAMP。脑片vehicle组SKF81297使动作电位增加34.7±12.8%，dynasore组为-2.78±4.9%。作者认为内吞支持快速多巴胺能信号。
传感器的构成
- 细胞基质：HEK293细胞或原代纹状体神经元，提供D1受体表达、内吞与cAMP信号环境
- 识别/触发元件：D1多巴胺受体（FD1R或SpH-D1R），结合DA或SKF81297并启动信号
- 信号转导元件：Gs/Golf与腺苷酸环化酶V（ACV），将受体激活转化为cAMP生成
- 传感识别元件：Epac1-cAMPs FRET生物传感器，含Epac1 cAMP结合域，结合cAMP后改变构象
- 荧光标记/换能元件：CFP供体与YFP受体，cAMP结合引起FRET效率变化，表现为YFP/CFP发射比值下降
- 读出装置：宽场荧光显微镜或TIRF显微镜，采集CFP/YFP通道并计算归一化FRET比值
中文摘要
D1型多巴胺受体是中枢神经系统多巴胺能信号的主要介导者。激动剂激活后，D1受体可快速内化，但这一过程的功能意义长期不明。本研究在HEK293细胞和原代纹状体神经元中，利用实时荧光成像与FRET型cAMP生物传感器（Epac1-cAMPs），同步分析D1受体转运与cAMP积累动力学。结果显示，多巴胺或D1选择性激动剂SKF81297可诱导D1受体在约30秒内聚集并进入内吞途径，其时间进程与急性cAMP升高重叠。高渗蔗糖、dynasore、clathrin siRNA以及D1受体胞内尾360–382缺失突变均抑制受体内吞，并显著削弱急性D1受体介导的cAMP积累；而抑制受体回收（EHD3敲低或bafilomycin A1）不影响急性cAMP反应。内吞后D1受体与早期内体膜上的Gs/Golf和腺苷酸环化酶V接近。结果表明，内吞及早期内吞途径并非仅清除受体，而是通过在内体膜上支持受体与下游信号分子接近，促进快速多巴胺能信号传导。
英文摘要
D(1) dopamine receptors are primary mediators of dopaminergic signaling in the CNS. These receptors internalize rapidly following agonist-induced activation, but the functional significance of this process is unknown. We investigated D(1) receptor endocytosis and signaling in HEK293 cells and cultured striatal neurons using real-time fluorescence imaging and cAMP biosensor technology. Agonist-induced activation of D(1) receptors promoted endocytosis of receptors with a time course overlapping that of acute cAMP accumulation. Inhibiting receptor endocytosis blunted acute D(1) receptor-mediated signaling in both dissociated cells and striatal slice preparations. Although endocytic inhibition markedly attenuated acute cAMP accumulation, inhibiting the subsequent recycling of receptors had no effect. Further, D(1) receptors localized in close proximity to endomembrane-associated trimeric G protein and adenylyl cyclase immediately after endocytosis. Together, these results suggest a previously unanticipated role of endocytosis, and the early endocytic pathway, in supporting rapid dopaminergic neurotransmission.