组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞质 NADH-NAD+ 氧化还原状态（NADH:NAD+ ratio / cytosolic NADH-NAD+ redox state）；样品基质：活细胞胞质/核（Neuro-2a、C6、MCF-10A 培养细胞及原代小鼠星形胶质细胞、神经元）
检测原理
Peredox 由环化置换 GFP T-Sapphire 插入 T-Rex 二聚体之间构成，T-Rex 为 NADH/NAD+ 结合支架。当胞质游离 NADH 结合 T-Rex 时，蛋白由开放构象转为闭合构象，改变 cpFP 色酚环境并提高绿色荧光量子产率；NAD+ 与 NADH 竞争结合，使稳态荧光响应主要反映 NADH:NAD+ 比值。初始 P0 对 [NADH]×[H+]/[NAD+] 敏感，Tyr98Trp 等突变消除质子转移导致的 pH 依赖，使 Peredox 在生理 pH 范围内稳定。串联 mCherry 提供表达量归一化，绿/红比值随 NADH 升高或 NAD+ 降低而增大。外源乳酸和丙酮酸通过内源 LDH 平衡校准传感器。该传感器无酶催化放大，依靠直接荧光换能实现活细胞单细胞成像。
检测灵敏度
半最大响应: KR0 = 0.12（P0, pH 7.2）；乳酸:丙酮酸半最大比值 ~40；葡萄糖半最大浓度 ~0.2 mM
效应效果
Peredox 对 NADPH、NADP+、烟酰胺、AMP 等无响应，ADP/ATP 干扰为毫摩尔级，NADH 相对 ADP/ATP 特异性约 30,000 倍，且不受 ATP:ADP 能量电荷变化影响。pH 抗性显著，pH 变化 1 单位 KR0 仅约 20%；NADH 解离时间常数 50 s（25°C）和 16 s（35°C），比 P0 的 25 min 快。NADH 饱和时荧光增强约 150%（2.5 倍），比 NAD(P)H 自荧光亮约 100 倍。在 Neuro-2a 中，乳酸:丙酮酸半最大比值约 40；葡萄糖使 NAD+:NADH 降至 70–130。原代星形胶质细胞较神经元更还原（p<0.01）。MCF-10A 高内容成像约 700 细胞/组，1 μM NVP-BEZ235 处理 1 h 降低 NADH，DMSO 无影响。
传感器的构成
- 荧光换能单元：环化置换 GFP T-Sapphire（cpFP T-Sapphire），插入 T-Rex 二聚体之间，NADH 结合引起构象变化并改变绿色荧光量子产率
- 识别元件：T-Rex（Thermus aquaticus Rex）NADH 结合蛋白二聚体，结合 NADH/NAD+，突变 Tyr98Trp 与 Phe189Ile 消除 pH 依赖并加快动力学
- 信号归一化元件：串联 mCherry 红色荧光蛋白，提供表达量归一化，用于绿/红荧光比值
- 表达定位元件：质粒或逆转录病毒载体表达 Peredox-mCherry；原代细胞中使用核定位序列 NLS 的 Peredox-NLS 避免 mCherry 溶酶体聚集
- 校准试剂：外源乳酸（lactate）与丙酮酸（pyruvate），通过内源乳酸脱氢酶（LDH）平衡设定胞质 NADH:NAD+
- 读出系统：共聚焦或宽场显微镜，405 nm 激发绿色荧光、575/578 nm 激发红色荧光，计算绿/红比值
中文摘要
NADH 是电子传递中的关键代谢辅因子，但在活细胞胞质中对其进行敏感、特异检测一直困难。作者将环化置换绿色荧光蛋白 T-Sapphire 与细菌 NADH 结合蛋白 Rex 结合，构建了胞质 NADH-NAD+ 氧化还原状态的荧光生物传感器。初始构建报告 [NADH]×[H+]/[NAD+]，通过定点突变消除其 pH 敏感性。工程化传感器 Peredox 可报告胞质 NADH:NAD+ 比值，并可用外源乳酸和丙酮酸进行校准。作者在多种培养细胞和原代细胞中验证了其应用。研究发现，糖酵解对抗乳酸脱氢酶平衡，使培养细胞胞质 NADH-NAD+ 氧化还原状态偏向还原态；原代小鼠星形胶质细胞与神经元在相同条件下呈现不同氧化还原状态，符合二者代谢差异的假设。此外，利用高内容图像分析，作者监测了数百个活细胞在 PI3K 通路抑制后的 NADH 响应。作为 NADH 报告器，Peredox 有望促进对细胞生物能量学的理解。
英文摘要
NADH is a key metabolic cofactor whose sensitive and specific detection in the cytosol of live cells has been difficult. We constructed a fluorescent biosensor of the cytosolic NADH-NAD(+) redox state by combining a circularly permuted GFP T-Sapphire with a bacterial NADH-binding protein, Rex. Although the initial construct reported [NADH] × [H(+)] / [NAD(+)], its pH sensitivity was eliminated by mutagenesis. The engineered biosensor Peredox reports cytosolic NADH:NAD(+) ratios and can be calibrated with exogenous lactate and pyruvate. We demonstrated its utility in several cultured and primary cell types. We found that glycolysis opposed the lactate dehydrogenase equilibrium to produce a reduced cytosolic NADH-NAD(+) redox state. We also observed different redox states in primary mouse astrocytes and neurons, consistent with hypothesized metabolic differences. Furthermore, using high-content image analysis, we monitored NADH responses to PI3K pathway inhibition in hundreds of live cells. As an NADH reporter, Peredox should enable better understanding of bioenergetics.