Rational design of fluorescent biosensor for cyclic di-GMP.

荧光生物传感器

环二鸟苷酸（c-di-GMP）；样品基质：体外缓冲液/酶反应体系（mPBS、Tris-HCl/KCl），可用于细胞 c-di-GMP 定量替代 LC-MS。

该传感器以 EALFimX 蛋白为识别元件，Cys484 位点共价连接环境敏感荧光染料 MDCC。c-di-GMP 与 EALFimX 结合后，不引起整体结构大幅改变，但导致 N 端叶局部构象重排，α0 螺旋展开，Cys484 附近微环境极性增加，MDCC 荧光强度下降。在 [c-di-GMP] < 3 μM 且 [biosensor] ≈ Kd 时，荧光强度与 c-di-GMP 浓度呈线性关系。DGC2 催化 GTP 合成 c-di-GMP 时，荧光随产物积累而下降；RocR 催化 c-di-GMP 水解时，荧光随底物消耗而上升。通过连续监测 419 nm 激发、466 nm 发射的荧光变化，可实时获得初始速率，无需酶催化沉积、HCR、RCA 等额外放大步骤。

线性范围: [c-di-GMP] < 3 μM（[biosensor] ≈ Kd）；Kd: 172±90 nM

484-MDCC 对 c-di-GMP 具有较高选择性，单磷酸、二磷酸、三磷酸核苷及环单磷酸核苷均不干扰；在实验条件下稳定，>2 h 荧光信号变化可忽略。与 c-di-GMP 结合后荧光降低 45%，Kd 为 172±90 nM，线性范围 <3 μM。该传感器可实时监测 DGC2 合成和 RocR 降解 c-di-GMP，平行 HPLC 酶活测定得到相似初始速率；DGC2 的 Vmax 为 0.4 μM/min、KM 为 2.3 μM，RocR 的 KM 为 3.2 μM。Ca2+ 对 RocR 的 IC50 为 141±10 μM。高通量筛选中快速识别 Rp-GTP-α-S 和 GDP 对 DGC2 的抑制作用。相比 HPLC 或放射性标记法，方法更快、无需放射性同位素，适用于 c-di-GMP 信号蛋白研究和抑制剂开发。

环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌中调控毒力表达、生物膜形成等过程的重要第二信使，其胞内水平由 GGDEF 结构域二鸟苷酸环化酶（DGC）合成和 EAL/HD-GYP 结构域磷酸二酯酶（PDE）降解共同控制。目前体外检测 DGC/PDE 酶活多依赖放射性标记 c-di-GMP 或 HPLC，操作复杂且通量低。本文基于铜绿假单胞菌 FimX 蛋白的非催化 EAL 结构域（EALFimX）设计了一种无试剂荧光生物传感器。EALFimX 对 c-di-GMP 具有高亲和力，且结合后发生局部构象变化。作者通过定点突变引入单一半胱氨酸，并用环境敏感荧光染料 MDCC 或 6-IAF 进行共价标记，筛选出 484-MDCC 共轭物。c-di-GMP 结合引起 α0 螺旋展开，使 MDCC 微环境极性增加，荧光强度下降。该传感器可在实时、高选择性条件下检测 c-di-GMP，并用于 DGC2 和 RocR 酶活测定及抑制剂高通量筛选。