组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
谷氨酸（glutamate, Glu）；样品基质：0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.0），文中面向脑脊液/细胞外液等生物体液
检测原理
谷氨酸进入电极表面后，被共价固定在 VACNTs 端部的 GLDH 催化氧化：谷氨酸 + NAD+ + H2O 在 GLDH 作用下生成 2-氧戊二酸、NADH、NH4+ 和 H+。NADH 是电化学活性产物，其浓度与谷氨酸浓度成正比。VACNTs 具有垂直排列、高导电和较大比表面积，可将酶活性中心与硅基底接触层之间的电子转移阻力降低，使 NADH 在较低阳极电位（约 −0.084 V，CV；DPV 峰约 −0.068 V）发生直接氧化；加入 1 μM thionine 时，thionine 作为电子介质进一步促进 NADH 氧化，峰位移至约 −0.012 V。差分脉冲伏安法读取阳极峰电流，峰电流随谷氨酸浓度升高而增大，从而实现无介质或低介质条件下的定量检测。
检测灵敏度
无电子介质：LOD: 57 nM（S/N = 3）；线性范围: 0.1–20 μM，灵敏度: 0.976 mA mM−1 cm−2；20–300 μM，灵敏度: 0.182 mA mM−1 cm−2。1 μM thionine：LOD: 68 nM（S/N = 3）；线性范围: 0.1–20 μM，灵敏度: 1.17 mA mM−1 cm−2；20–500 μM（摘要）/20–300 μM（正文），灵敏度: 0.153 mA mM−1 cm−2。
效应效果
该传感器抗干扰性好：在含 0.2 mM AA 和 UA 的 PBS 中，谷氨酸、AA、UA 伏安峰分离，可选择性同时检测。PBS 中 4 ℃ 保存两周，对 0.1 mM 谷氨酸响应第 3 天由 2.354 μA 降至 2.22 μA，保留 94.3%；两周后保持初始值 80.5%（1.88 μA）。其检出限优于 GlOx 微传感器（2.5 μM）和 thionine/SWCNT 电极（0.1 μM），线性范围宽于 Tang（0.2–250 μM）和 Meng（0.5–400 μM），灵敏度高于 Meng（137.3 μA mM−1 cm−2）和 Rahman（281.6 μA mM−1 cm−2）。未报告 RSD 和实际样品回收率。作者认为适用于细胞外 4–300 μM 生理水平谷氨酸检测及体内实验。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：p 型 (100) 硅片（Si wafer），经 POCl3 磷扩散形成高掺杂接触层，作为导电工作电极基底
- 催化成核层：Ni 薄膜（8–10 nm，电子束蒸发）及氢化形成的 Ni 纳米岛，用于 DC-PECVD 生长 VACNTs
- 纳米修饰层：垂直排列碳纳米管（VACNTs），DC-PECVD 由 C2H2/H2 生长，直径 70–100 nm、长度约 1 μm，提供导电通道与酶固定化载体
- 界面功能化层：VACNTs 端基经 1 M NaOH 电化学氧化生成羧基（–COOH），用于与酶共价连接
- 识别元件：谷氨酸脱氢酶（GLDH），经 EDC/sulfo-NHS 与 –COOH 形成酰胺键共价固定于 VACNTs 端部，催化谷氨酸反应
- 辅因子/电子受体：NAD+（磷酸盐缓冲液中 2 mM），作为 GLDH 反应辅酶，被还原为 NADH 产生电化学信号
- 封闭剂：牛血清白蛋白（BSA，0.2%），在 PBS 中洗涤以封闭非特异性位点
- 电子介质（可选）：硫黄素（thionine，1 或 5 μM），促进 NADH 向电极的电子转移
中文摘要
本文报道了一种基于谷氨酸脱氢酶/垂直排列碳纳米管（GLDH/VACNTs）的高灵敏谷氨酸生物传感器。垂直排列碳纳米管通过直流等离子体增强化学气相沉积（DC-PECVD）法在硅基底上生长，并用循环伏安法和电化学阻抗谱表征其电化学行为。谷氨酸脱氢酶通过 EDC/sulfo-NHS 共价偶联到 VACNTs 端部。采用循环伏安法和差分脉冲伏安法考察电极对谷氨酸的电化学检测性能，在无电子介质及含 1、5 μM 硫黄素条件下进行测定。谷氨酸浓度与峰电流的线性校准范围为 0.1–500 μM。无电子介质传感器检出限为 57 nM，在 0.1–20 μM 和 20–300 μM 两段线性范围内灵敏度分别为 0.976 mA mM−1 cm−2 和 0.182 mA mM−1 cm−2；加入 1 μM 硫黄素时检出限为 68 nM，0.1–20 μM 和 20–500 μM 范围内灵敏度分别为 1.17 mA mM−1 cm−2 和 0.153 mA mM−1 cm−2。还考察了其他生物分子干扰和响应稳定性，结果表明该 GLDH/VACNTs 电极即使不使用电子介质也适合作为谷氨酸检测的基础电极。
英文摘要
A sensitive glutamate biosensor is prepared based on glutamate dehydrogenase/vertically aligned carbon nanotubes (GLDH, VACNTs). Vertically aligned carbon nanotubes were grown on a silicon substrate by direct current plasma enhanced chemical vapor deposition (DC-PECVD) method. The electrochemical behavior of the synthesized VACNTs was investigated by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopic methods. Glutamate dehydrogenase covalently attached on tip of VACNTs. The electrochemical performance of the electrode for detection of glutamate was investigated by cyclic and differential pulse voltammetry. Differential pulse voltammetric determinations of glutamate are performed in mediator-less condition and also, in the presence of 1 and 5 μM thionine as electron mediator. The linear calibration curve of the concentration of glutamate versus peak current is investigated in a wide range of 0.1-500 μM. The mediator-less biosensor has a low detection limit of 57 nM and two linear ranges of 0.1-20 μM with a sensitivity of 0.976 mA mM(-1) cm(-2) and 20-300 μM with a sensitivity of 0.182 mA mM(-1) cm(-2). In the presence of 1 μM thionine as an electron mediator, the prepared biosensor shows a low detection limit of 68 nM and two linear ranges of 0.1-20 with a calibration sensitivity of 1.17 mA mM(-1) cm(-2) and 20-500 μM with a sensitivity of 0.153 mA mM(-1) cm(-2). The effects of the other biological compounds on the voltammetric behavior of the prepared biosensor and its response stability are investigated. The results are demonstrated that the GLDH/VACNTs electrode even without electron mediator is a suitable basic electrode for detection of glutamate.