组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
细胞内钙离子（intracellular Ca2+）；样品基质为 HeLa、COS7、CHO 活细胞及转基因 C. elegans 咽部肌肉。
检测原理
该传感器基于基因编码钙指示剂的荧光换能机制。TN-XL 中，鸡骨骼肌肌钙蛋白 C（TnC）作为 Ca2+ 识别域，位于 ECFP 与 citrine 之间；胞内 Ca2+ 浓度升高时，Ca2+ 结合 TnC 引起构象变化，改变 ECFP 与 citrine 的距离和取向，从而改变 FRET 效率，表现为 535 nm/480 nm 发射比变化。GCaMP2 中，Ca2+ 结合钙调蛋白（CaM）后，肌球蛋白轻链激酶肽段（M13）与循环置换 EGFP（cpEGFP）结合，恢复或增强 EGFP 荧光，表现为 F/F0 强度变化。分裂 GECI 的 N 端和 C 端片段分别融合 NpuDnaEN 与 NpuDnaEC，两片段结合后发生蛋白跨剪接，共价连接外显子并切除 intein，留下 CFNGT 残基，形成功能 GECI。因此只有发生剪接的细胞才产生与 Ca2+ 浓度相关的荧光信号。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
在 HeLa、COS7 和 CHO 细胞中，重组分裂 TN-XL 的 FRET 动态范围为 1.1±0.2，显著低于天然 TN-XL 的 1.7±0.4（p<0.001，n=3）。重组分裂 GCaMP2 的动态范围为 2.75±0.41，与天然 GCaMP2 的 2.79±0.10 无统计学差异（p=0.004，n=3）；CFNGT 替换连接区的 GCaMP2 为 2.62±0.29，与未改变 GCaMP2 的 2.75±0.10 无显著差异（p=0.02，n=3）。非剪接对照和单个片段均无荧光或钙响应，说明信号依赖 intein 剪接。转基因线虫中，分裂 GCaMP2 在咽部肌肉三个区域表达，5-HT 刺激后钙成像轮廓与天然 GCaMP2 相似。作者认为该系统可用两个互补启动子实现更精确的细胞类型靶向。
传感器的构成
- 表达/成像基质：HeLa、COS7、CHO 细胞或转基因 C. elegans 咽部肌肉细胞，提供 GECI 表达与胞内 Ca2+ 成像环境
- 识别元件：鸡骨骼肌肌钙蛋白 C（TnC，TN-XL）或钙调蛋白（CaM，GCaMP2），特异性结合 Ca2+ 并引发构象变化
- 信号标记物：ECFP/citrine（TN-XL 的 FRET 供体-受体对）或循环置换 EGFP（cpEGFP，GCaMP2 单荧光报告），将 Ca2+ 结合转换为 FRET 或荧光强度变化
- 重组元件：Nostoc punctiforme 分裂 DnaE intein 的 N 端和 C 端片段（NpuDnaEN、NpuDnaEC），介导 GECI 片段的蛋白跨剪接共价重组
- 靶向/定位元件：myo-2 启动子（myo-2p）驱动线虫咽部肌肉表达；Lyn 膜定位信号用于验证 intein 剪接
- 读出系统：倒置荧光显微镜（IX81/MVX10）与 CCD 相机，配合 FRET 滤光片或 EGFP 滤光片采集 535/480 nm 发射比或 F/F0 荧光强度
中文摘要
基因编码钙指示剂（GECIs）可在模式生物中实现钙离子成像，但其表达通常受单一启动子控制，可能超出目标细胞类型。为提高细胞类型特异性，可将 GECI 置于两个启动子交叉表达的控制下。本文利用来自 Nostoc punctiforme 的分裂 DnaE intein（NpuDnaE）介导两种代表性 GECI（TN-XL 和 GCaMP2）的分裂与重组。NpuDnaE 的 N 端和 C 端片段在细胞内发生蛋白跨剪接，共价连接 GECI 片段并切除 intein。重组的分裂 TN-XL 可实现比率钙成像，但其钙响应较天然 TN-XL 明显降低；而分裂 GCaMP2 保留了与天然 GCaMP2 相似的钙响应。进一步将分裂 GCaMP2 靶向秀丽隐杆线虫咽部肌肉，成功成像进食线虫的钙信号。结果表明，利用两个互补启动子提高 GECI 的细胞类型靶向性是可行的。
英文摘要
While genetically encoded Ca(2+) indicators (GECIs) allow Ca(2+) imaging in model organisms, the gene expression is often under the control of a single promoter that may drive expression beyond, the cell types of interest. To enable more cell-type specific targeting, GECIs can be brought under the, control of the intersecting expression from two promoters. Here, we present the splitting and, reassembly of two representative GECIs (TN-XL and GCaMP2) mediated by the split intein from Nostoc, punctiforme (NpuDnaE). While the split TN-XL biosensor offered ratiometric Ca(2+) imaging, it had a, diminished Ca(2+) response relative to the native TN-XL biosensor. In contrast, the split GCaMP2, biosensor retained similar Ca(2+) response to the native GCaMP2. The split GCaMP2 biosensor was, further targeted to the pharyngeal muscles of Caenorhabditis elegans where Ca(2+) signals from feeding C. elegans, were imaged. Thus, we envision that increased cell-type targetability of GECIs is feasible with two, complementary promoters.