组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
RhoA GTPase 活性（RhoA activity）、Cdc42 GTPase 活性（Cdc42 activity）；样品基质：活细胞（MEF、GP2-293 细胞内）
检测原理
RhoA检测采用基因编码CFP/YFP FRET生物传感器：活性RhoA-GTP与传感器效应结合域结合后，传感器构象改变，CFP供体与YFP受体之间的距离或取向发生变化，FRET效率随之改变，CFP/YFP荧光比率反映RhoA活性状态。Cdc42检测采用CBD-MBP结合域，其与活性Cdc42-GTP结合后改变Mero87和Atto-700双染料的局部溶剂极性或微环境，使两染料荧光强度比率发生变化。系统通过四通道宽场显微同步或顺序采集CFP、YFP、Mero87和Atto700信号，经图像配准后计算比率，从而在单活细胞中同时读出两种GTPase活性。该方法无化学放大，主要依赖比率型荧光、低表达控制和低背景成像介质。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法强调通过tet-OFF诱导和逆转录病毒转导将RhoA传感器表达控制在内源RhoA的20–30%，以降低显性负效应；宽场表观荧光在细胞最暗边缘的信噪比约为2:1。双相机同步采集可消除顺序采集中的运动伪影，图像配准精度可达1/20像素。四通道系统能在单个活细胞中同时读取RhoA的CFP/YFP FRET比率和Cdc42的Mero87/Atto700染料比率。成像介质经Argon脱氧和Oxyfluor处理以降低背景与活性氧；每个激发波长光强约0.5 mW±5%，ND1.0下曝光约1000 ms，可填充约80%相机动态范围。作者主张该方法适用于研究Rho GTPase在细胞前缘运动中的时空协调。
传感器的构成
- 细胞基底：25-mm #1.5 圆形盖玻片（Warner Instruments），用于细胞贴附、显微成像与温度控制腔装配
- 细胞表达系统：MEF 或 GP2-293 细胞、pRetro-X-tet-OFF 逆转录病毒系统，用于诱导表达 RhoA 生物传感器
- 识别元件（RhoA）：基因编码单链 RhoA 生物传感器，含 CFP/YFP FRET 模块，识别 RhoA 效应结合事件
- 识别元件（Cdc42）：CBD-MBP（Cdc42 结合域-麦芽糖结合蛋白）融合蛋白，识别内源 Cdc42 活性状态
- 信号标记物（RhoA）：CFP/YFP 荧光蛋白对，FRET 效率随 RhoA 激活状态改变，提供比率型荧光信号
- 信号标记物（Cdc42）：Mero87-iodoacetamide 与 Atto-700-NHS 双染料，结合/溶剂极性变化引起荧光比率改变
- 读出系统：倒置组织培养显微镜、CCD 相机、带通滤光片、二向色镜和分束器，采集 CFP/YFP/Mero87/Atto700 四通道荧光
中文摘要
本文提供了在单通道和多通道成像模式下对Rho家族GTPase生物传感器进行活细胞成像的实验程序。多通道方法可在单个活细胞中直接同时可视化两种生物传感器读数。作者以基于CFP/YFP FRET的RhoA生物传感器和基于溶剂极性敏感有机染料的Cdc42生物传感器为例，系统列出实现双比率型生物传感器成像所需的光学组件、滤光片、二向色镜、分束器、CCD相机以及细胞操作技术。方法涵盖基因编码传感器的诱导表达、逆转录病毒转导、稳定细胞系构建、CBD-MBP蛋白的Mero87与Atto-700双染料标记、低氧低背景成像介质制备、四通道宽场显微采集、图像配准和比率计算等关键步骤，用于研究活细胞内Rho GTPase活性的时空动态及其在细胞前缘运动中的协调机制。
英文摘要
Here, we provide procedures for imaging the Rho GTPase biosensors in both single and multiplex acquisition modes. The multiplex approach enables the direct visualization of two biosensor readouts from a single living cell. Here, we take as an example a combination of the RhoA biosensor based on a CFP/YFP FRET modality and the Cdc42 biosensor based on organic dyes that change fluorescence as a function of the local solvent polarity. We list the required optical components as well as cellular manipulation techniques necessary to successfully image these two ratiometric biosensors in a single living cell.