组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
Ras（小GTP酶）、c-Raf（丝氨酸/苏氨酸激酶）、CrkII（酪氨酸激酶底物）、ERK（丝裂原活化蛋白激酶）、Rac1/Cdc42/RhoA（Rho家族GTP酶）、S6K/RSK（激酶）、BCR-ABL（酪氨酸激酶）；样品基质为活细胞、3D Matrigel、肿瘤/脑组织
检测原理
FRET生物传感器由供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感域、配体域和连接肽组成。传感域感知GTP结合、磷酸化或底物/配体结合等信号后发生构象变化，配体域随之结合，使供体与受体荧光蛋白之间的距离或取向改变。FRET效率取决于供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠、两荧光团距离及取向；距离缩短或取向平行时效率升高。用特定波长激发供体（如CFP约433 nm），受体（如YFP约530 nm）产生敏化荧光，YFP/CFP比值反映信号分子活性。EV linker（116 aa）可消除荧光蛋白二聚化背景，使响应主要依赖距离，提高增益。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该文为综述，未报告RSD、回收率或LOD等定量指标。作者指出，CFP/YFP型FRET传感器在转染线性化质粒或逆转录病毒转导中常因CFP与YFP同源重组而丢失表达；TFP/YFP可避免逆转录病毒重组，但增益下降；piggyBac转座子可高效稳定表达CFP/YFP传感器。稳定表达HeLa细胞系EKAREV-nuc可读出ERK活性，用于抗癌药物筛选，单次实验可缩小至约100个细胞，并可在同一实验中使用最多3种不同亚细胞定位的FRET传感器。FRET传感器已用于观察Ras、c-Raf、CrkII、BCR-ABL及Rho家族GTP酶在活细胞、3D Matrigel和肿瘤组织中的时空活性。
传感器的构成
- 供体荧光蛋白：CFP、Turquoise或TFP，作为FRET供体，接受激发后向受体非辐射转移能量
- 受体荧光蛋白：YFP、YPet或Venus，作为FRET受体，接收能量后发射特征荧光
- 传感域：Ras、c-Raf、CrkII、ERK、Rac1等，感知GTP结合、磷酸化或底物结合并发生构象变化
- 配体域：Raf RBD等，结合构象变化后的传感域，使供体与受体距离或取向改变
- 连接肽：EV linker（116个氨基酸）等，连接传感域与配体域，降低二聚化背景并提高FRET增益
- 成像换能器：荧光显微镜、共聚焦显微镜或双光子显微镜，激发供体并采集供体/受体荧光比值
中文摘要
肿瘤信号转导通路的组成分子是抗癌药物的重要靶点。尽管已有大量关于这些分子性质的知识，但信号分子在活细胞中的时空调控仍不清楚。基于荧光共振能量转移（FRET）原理的生物传感器已被开发用于在活细胞中可视化信号分子活性。然而，高灵敏度FRET生物传感器开发困难，限制了其在癌症研究中的广泛应用；缺乏稳定表达FRET生物传感器的细胞系也制约了其使用。本综述介绍FRET生物传感器的基本原理，描述优化后的FRET生物传感器骨架，介绍在细胞中稳定表达FRET生物传感器的技术，并讨论FRET生物传感器在癌症研究中的未来应用前景。
英文摘要
The constituents of the oncogene signal transduction pathway are promising targets for anticancer drugs. Despite the wealth of available knowledge regarding their molecular properties, the spatiotemporal regulation of the signaling molecules remains elusive. Biosensors based on the principle of FRET have been developed to visualize the activities of the signaling molecules in living cells. However, difficulties in the development of sensitive FRET biosensors have prevented their widespread use in cancer research. The lack of cell lines constitutively expressing a FRET biosensor has also limited their use. In this review, we will introduce the principle of FRET-based biosensors, describe an optimized backbone of the FRET biosensors, techniques to express FRET biosensors stably in the cells, and discuss the future perspectives of FRET biosensors in cancer research.