组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
microRNA（miRNA，miR-20、let-7a），样品基质为缓冲液中的合成 miRNA（HBSS/PBS）
检测原理
固定于盖玻片上的 LNA-DNA 捕获探针与目标 miRNA 互补杂交，形成稳定的探针-miRNA 复合物。随后加入 poly(U) 聚合酶和 UTP，酶以杂交 miRNA 为模板催化 UTP 掺入，每掺入一个 UTP 即释放一个焦磷酸（PPi），实现信号放大。释放的 PPi 与 APS 在 ATP 磺基转移酶催化下转化为 ATP。ATP 进一步作为荧光素酶/荧光素生物发光反应的底物，产生与 ATP 量成正比的光信号。由于 miRNA 浓度越高，模板越多，聚合反应释放的 PPi 和生成的 ATP 越多，最终化学发光强度随 miRNA 浓度升高而增强，经 ICCD 成像读出。
检测灵敏度
LOD: 50 fM；线性范围: 50 fM–4.0 pM
效应效果
在 20 pM 目标 miR-20 条件下产生强化学发光信号，而非互补 let-7a 对照仅略高于空白，表明 LNA 探针具有良好序列特异性。poly(U) 聚合酶反应 30 min 后信号达到最大并保持稳定。方法线性范围为 50 fM–4.0 pM，LOD 为 50 fM，优于或相当 Northern blotting（1 nM）、电化学（2 pM）、荧光（25 fM）、SPR 成像（10 pM）和荧光相关光谱（500 fM）。双探针阵列可实现 miR-20 与 let-7a 多组分检测，且洗涤后保留 95% 响应，可重复使用。
传感器的构成
- 基底：盖玻片（cover slip），作为光学反应载体与成像基底
- 硅烷化修饰层：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），在玻璃表面形成氨基功能化层
- 交联活化层：戊二醛（glutaraldehyde），活化氨基并形成醛基以共价固定探针
- 识别元件：3′-氨基修饰 LNA-DNA 寡核苷酸捕获探针（miR-20 LNA、let-7a LNA），与目标 miRNA 互补杂交
- 封闭剂：1% 牛血清白蛋白（BSA），封闭剩余活性位点并降低非特异结合
- 信号放大元件：poly(U) 聚合酶（poly(U) polymerase）与尿苷三磷酸（UTP），以杂交 miRNA 为模板催化聚合并释放 PPi
- 信号转换元件：腺苷磷酸硫酸盐（APS）与 ATP 磺基转移酶（ATP sulfurylase），将 PPi 转化为 ATP
- 发光标记物：荧光素（D-luciferin）与荧光素酶（luciferase），利用 ATP 产生生物发光信号
中文摘要
本文报道了一种基于化学发光成像和 poly(U) 聚合酶催化聚合的 microRNA（miRNA）高灵敏检测方法。将 3′-氨基修饰的 LNA-DNA 捕获探针通过 APTES 和戊二醛共价固定于盖玻片表面，并用 BSA 封闭。目标 miRNA 与探针杂交后，poly(U) 聚合酶以 miRNA 为模板催化 UTP 掺入，释放大量焦磷酸（PPi）；PPi 在 ATP 磺基转移酶和腺苷磷酸硫酸盐（APS）作用下转化为 ATP，再由荧光素酶/荧光素体系产生生物发光，经 ICCD 相机成像。该方法检出限为 50 fM，线性范围为 50 fM–4.0 pM，灵敏度与现有方法相当或更优。通过在不同阵列位点固定不同捕获探针，可实现 miRNA 多组分检测，适用于多种研究用途。
英文摘要
We have developed a new methodology for miRNA assay using chemiluminescence imaging by poly(U) polymerase catalyzed miRNA polymerization. This method is very sensitive with a 50 fM limit of detection, which is comparable to or better than current assay methods. Multiplex detection for miRNA can be easily realized by introducing different capture probes onto the biosensor array, which will make it highly versatile for various research purposes.