组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
LGR5-exo-Fc（LGR5 外域-Fc 融合蛋白）、RSPO1-FH（Flag-HA 双标签人 RSPO1）；样品基质：细胞培养上清/10 mM Mes buffer（pH 5.5）。
检测原理
anti-Flag 或 anti-HA 抗体点阵先定向捕获 RSPO1-FH，anti-Fc 点阵同时捕获 LGR5-exo-Fc；随后系列稀释的 LGR5-exo-Fc 与捕获的 RSPO1-FH 发生特异性结合。结合使芯片表面质量/折射率增加，SPR 阵列成像实时记录各点响应。由于不同抗体点阵密度和不同分析物浓度会引入再结合、质量传输、非特异结合、多价/空间位阻等干扰，方法将各点按 1:1 模型拟合得到的 kd 和 KD 对捕获响应 RL（或 Rmax）作指数拟合，并外推至零响应，模拟单配体-单分析物相互作用，从而得到更接近溶液状态的 KD_R0。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法通过多密度抗体点阵、系列稀释分析物和零响应外推，降低再结合、质量传输、非特异结合及多价/空间位阻干扰；参考点补偿体相折射率变化。对 LGR5-exo-Fc–RSPO1-FH 体系，至少 25 个自动循环获得传感器图；表观 KD 随 RL 从 3×10^-9 M 增至 8×10^-9 M，kd 从 8×10^-5 s^-1 增至 1.5×10^-4 s^-1，外推得 KD_R0=3.1×10^-9 M、kd_R0=1.55×10^-4 s^-1、ka_R0=5.0×10^4 M^-1 s^-1。Rmax/RL 约 5，与分子量比 177/35 kDa 一致。作者认为其更接近溶液单分子亲和常数。
传感器的构成
- 基底/换能器：Easy2Spot 传感器芯片（IBIS Technologies），承载微点阵并支持 SPR 成像。
- 识别元件：mouse anti-Flag 抗体点阵，8 倍系列稀释点样，定向捕获 RSPO1-FH 的 Flag 标签。
- 识别元件：mouse anti-HA 抗体点阵，8 倍系列稀释点样，定向捕获 RSPO1-FH 的 HA 标签。
- 识别元件：goat anti-human IgG-Fc 抗体点阵，捕获 LGR5-exo-Fc 的 Fc 标签并同步监测结合。
- 参考/对照点：HSA、anti-HSA 或空点，用于补偿体相折射率变化和非特异背景。
- 流动相/缓冲液：10 mM Mes buffer（pH 5.5），用于点样和样品流动接触。
- 再生/清洗：Gly-HCl 10 mM（pH 2.0）再生缓冲液，用于解离结合物并恢复芯片循环。
- 信号标记物：无（label-free SPR，直接监测结合引起的表面响应变化）。
中文摘要
亲和常数（kd、ka 和 KD）可通过固定化配体方法（如免疫分析和无标记生物传感器技术）测定。本文提出一种新的表面等离子共振（SPR）阵列成像方法，可获得可视为单生物分子相互作用最佳估计的亲和常数。该方法将不同配体密度和分析物浓度下测得的速率常数（kd、ka）及解离平衡常数（KD）外推至零响应水平（KD_R0），从而模拟仅一个配体分子与一个分析物分子相互作用的真实 1:1 结合，最大限度降低再结合、质量传输限制、非特异结合、多价/空间位阻及固定化异质性等干扰。作者以 LGR5-exo-Fc–RSPO1-FH 相互作用为模型，采用 Easy2Spot 芯片、anti-Flag/anti-HA/anti-Fc 抗体点阵和 IBIS MX96 仪器进行无标记 SPR 阵列分析，通过至少 25 个自动分析循环获得传感器图，并将表观 KD 和 kd 对捕获响应 RL 或 Rmax 外推至零。最终确定 LGR5-exo-Fc 与 RSPO1-FH 的 KD_R0 为 3.1 nM，kd_R0 为 1.55×10^-4 s^-1，ka_R0 为 5.0×10^4 M^-1 s^-1。
英文摘要
Affinity constants (k(d), k(a), and K(D)) can be determined by methods that apply immobilized ligands such as immunoassays and label-free biosensor technologies. This article outlines a new surface plasmon resonance (SPR) array imaging method that yields affinity constants that can be considered as the best estimate of the affinity constant for single biomolecular interactions. Calculated rate (k(d) and k(a)) and dissociation equilibrium (K(D)) constants for various ligand densities and analyte concentrations are extrapolated to the K(D) at the zero response level (K(D)(R0)). By applying this method to an LGR5-exo-Fc-RSPO1-FH interaction couple, the K(D)(R0) was determined as 3.1 nM.