组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Rac1 活性（Rac1 activity）、RhoA 活性（RhoA activity）、Cdc42 活性（Cdc42 activity）；样品基质：MDCK 细胞囊泡/管状上皮三维培养（Matrigel）中的顶膜与侧膜。
检测原理
Raichu FRET 生物传感器由 TFP1 供体、YFP 受体和 Rac1 结合模块组成。Rac1 的 GTP/GDP 活性状态改变结合模块构象，进而改变 TFP1 与 YFP 之间的距离或取向，使 FRET 效率发生可逆变化。在活细胞中，扫描共聚焦显微镜分别采集 TFP 和 YFP 通道荧光，通过计算 FRET/TFP 比值反映局部 Rac1 活性水平。比值升高或降低对应 Rac1 活性增强或减弱。由于探针组成性表达于 MDCK 细胞，可在 Matrigel 囊泡形成过程中对顶膜、侧膜等区域进行实时、无外源标记的定量成像，从而绘制 Rac1 活性空间分布图。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该 FRET 探针可稳定表达于 MDCK 细胞，避免传统 CFP-YFP Raichu 探针的基因组内重组，适合长期活细胞成像。定量分析显示，晚期囊泡侧膜 Rac1 活性显著高于顶膜（***P<0.001），RhoA 早期侧膜活性较高而晚期消失，Cdc42 顶膜活性持续较高。雷帕霉素诱导系统可在 1 min 内使 FKBP 融合蛋白转位至质膜，并快速改变 Rac1 活性（***P<0.001）。成熟囊泡中激活 Rac1 后，71%（n=275）囊泡出现腔内填充，对照组为 14%（n=305）；细胞数量无显著差异，排除增殖加速。Rac1 激活导致紧密连接蛋白 ZO-1 缺失、极化标记错定位和有丝分裂轴垂直于囊壁；Rac1 抑制主要扰动顶膜蛋白转运。结果支持顶膜 Rac1 抑制对囊泡结构维持的关键作用。
传感器的构成
- 表达基底：MDCK 细胞（Madin-Darby canine kidney cells），作为活细胞表达平台，在 Matrigel 中形成囊泡/管状结构
- 培养基质：Matrigel，提供三维细胞外基质，支持囊泡形成与极性建立
- 荧光供体：TFP1（teal fluorescent protein 1），替代传统 Raichu 探针中的 CFP，提供供体荧光并降低与 GFP 序列同源导致的基因组内重组
- 荧光受体：YFP（yellow fluorescent protein）衍生序列，与 TFP1 构成 FRET 对，其荧光受 Rac1 活性调控
- 识别元件：Raichu-Rac1 探针中的 Rac1 结合模块，识别 Rac1 的 GTP/GDP 活性状态并改变 FRET 效率
- 信号标记物：TFP1-YFP FRET 供体-受体对，作为内源荧光信号标记，无需外源标记
- 读出系统：扫描共聚焦显微镜，采集 TFP 与 YFP 通道并计算 FRET/TFP 比值
中文摘要
本研究利用组成性表达 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞，实时监测上皮囊泡形成过程中 Rac1 的时空活性。作者将传统 Raichu 探针中的 CFP 替换为 TFP1，降低与 GFP 序列同源导致的基因组内重组，从而建立稳定表达 Raichu-Rac1、Raichu-RhoA 和 Raichu-Cdc42 的 MDCK 细胞系。在 Matrigel 三维培养中，早期囊泡形成阶段 Rac1 活性在整个质膜上分布均匀；晚期阶段侧膜 Rac1 活性高于顶膜。若通过雷帕霉素诱导系统使 Tiam1 转位至膜上并在晚期激活顶膜 Rac1，单层细胞会向腔内空间迁移，导致囊泡腔填充；同时紧密连接被破坏，极化标记物错定位，有丝分裂轴方向紊乱。相反，抑制 Rac1 主要影响顶膜蛋白转运，但不显著改变成熟囊泡形态。结果表明，顶膜 Rac1 活性的抑制对维持囊泡结构完整性至关重要。
英文摘要
Using MDCK cells that constitutively express a Förster resonance energy transfer biosensor, we found that Rac1 activity is homogenous at the entire plasma membrane in early stages of cystogenesis, whereas in later stages Rac1 activity is higher at the lateral membrane than at the apical plasma membrane. If Rac1 is activated at the apical membrane in later stages, however, the monolayer cells move into the luminal space. In these cells, tight junctions are disrupted, accompanied by mislocalization of polarization markers and disorientation of cell division. These observations indicate that Rac1 suppression at the apical membrane is essential for the maintenance of cyst structure.