组成图示
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传感器类型
其他（共振镜生物传感器）
检测对象
EGCG（epigallocatechin-gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯）；样品基质：10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7），部分实验含饱和 DHF 或 NADPH。
检测原理
大肠杆菌 wt-DHFR 经 EDC/NHS 共价固定于 IAsys 羧基化共振镜表面，乙醇胺封闭后形成识别层。缓冲液中的 EGCG 流过表面时，可结合 DHFR 的 DHF 位点和 NADPH 位点，使表面质量/光学性质改变，共振镜角度（arcsec）随结合量增加而上升，直至平衡。由于 EGCG 与两个位点结合，未饱和 DHFR 上出现双相结合/解离曲线；加入饱和 DHF 或 NADPH 后分别封闭对应位点，曲线变为单相，从而区分位点。信号无化学放大，直接反映 EGCG 与固定化 DHFR 的结合量，并用于拟合 kass、kdiss 和平衡解离常数。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该研究未报告传感器选择性、抗干扰、RSD、实际样品回收率或与 ELISA/HPLC/qPCR 的定量对比。生物传感器显示 EGCG 与大肠杆菌 DHFR 结合呈双相动力学，提示其同时结合 DHF 和 NADPH 位点；未饱和时 K4=3.6±0.4 μM、K6=17±6 μM，DHF 或 NADPH 饱和后分别得到 K5=3.2±0.4 μM 和 K11=3.74±0.05 μM。EGCG 对 DHF 位点结合速率约为 NADPH 位点 30 倍，NADPH 位点解离更慢；NADPH 饱和使 DHF 位点 kdiss 从 0.082 s^-1 降至 0.012 s^-1。作者认为 EGCG 是慢结合双底物抑制剂，茶儿茶素具化学预防潜力。
传感器的构成
- 基底/换能器：IAsys carboxylate cuvette（羧基化共振镜比色皿），提供共价固定表面并产生光学响应
- 活化层：EDC/NHS（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide / N-hydroxysuccinimide），活化表面羧基以偶联 DHFR
- 识别元件：wt-DHFR from E. coli（大肠杆菌野生型二氢叶酸还原酶），固定于表面作为 EGCG 结合识别元件
- 封闭剂：ethanolamine 1 M（乙醇胺），封闭未反应羧基并去除静电吸附物
- 运行缓冲液：10 mM phosphate buffer pH 7（磷酸盐缓冲液），用于平衡、结合与洗脱
- 再生液：10 mM CH3COONa buffer pH 5.2（醋酸钠缓冲液），降低 EGCG-DHFR 复合物稳定性并再生表面
- 读出系统：IAsys plus 共振镜生物传感器与 Fast Fit 软件，监测结合响应（arcsec）并拟合动力学/平衡常数
中文摘要
二氢叶酸还原酶（DHFR）是广泛存在于生物体中的酶，参与 DNA 合成、细胞分裂及癌症抑制等重要过程，其调控一直是结构、动力学和药理学研究的重点。此前研究表明，绿茶儿茶素是牛肝和鸡肝 DHFR 的强效抑制剂。本文报道了来自大肠杆菌的野生型 DHFR 被表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）抑制的动力学结果。作者采用酶动力学、生物传感器和分子建模等多种分析技术，证明 EGCG 对大肠杆菌 DHFR 表现为双底物抑制剂。生物传感器结合实验显示，EGCG 可同时结合酶的底物（DHF）位点和辅因子（NADPH）位点，并呈现慢结合抑制特征。综合结果进一步确认了抗叶酸化合物对细菌源与哺乳动物源 DHFR 的选择性差异，并提示茶儿茶素可能作为化学预防剂发挥作用。
英文摘要
Dihydrofolate reductase (DHFR) is a ubiquitous enzyme involved in major biological process, including DNA synthesis and cancer inhibition, and its modulation is the object of extensive structural, kinetic, and pharmacological studies. In particular, earlier studies showed that green tea catechins are powerful inhibitors of bovine liver and chicken liver DHFR. In this article, we report the results of inhibition kinetics for the enzyme from another source (DHFR from E. coli) exerted by (-)-epigallocatechingallate (EGCG). Using different analytical techniques, we reported that EGCG acts as a bisubstrate inhibitor on the bacterial DHFR. Moreover, the combined approach of biosensor, kinetic, and molecular modelling analysis disclosed the ability of EGCG to bind to the enzyme both on substrate (DHF) and cofactor (NADPH) site. Collectively, our data have confirmed the selectivity of antifolate compounds with respect to the different source of enzyme (bacterial or mammalian DHFR) and the possible role of tea catechins as chemopreventive agents.