组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
microRNA-21（miRNA-21）；样品基质：细胞总RNA（人肝癌BEL-7402细胞、正常人肝L02细胞）及缓冲液标准品
检测原理
LNA-MB探针通过5′端巯基自组装固定于DenAu/graphene/GCE表面，呈茎环结构。目标miRNA-21与探针5′端互补区杂交后，茎环打开，探针3′端暴露并与AuNPs生物条形码上的LNA报告DNA杂交，使电极表面引入多个AuNPs及生物素。链霉亲和素-HRP经生物素-亲和素作用结合到电极，催化H2O2氧化对苯二酚生成对苯醌。对苯醌在-0.2 V发生电化学还原，产生与miRNA-21浓度相关的电流。石墨烯和DenAu增大电极面积并提高导电性，AuNPs条形码提供多价生物素，HRP催化放大对苯醌信号，从而实现无标记、无PCR扩增的高灵敏检测。
检测灵敏度
LOD: 0.06 pM；线性范围: 0.1–70 pM；回归方程: I = 0.29 log c + 0.43；斜率: 0.29（对log c）；R = 0.9956
效应效果
该传感器对序列特异性良好：1 pM目标miRNA-21电流为0.46 μA，单碱基错配、三碱基错配和非互补序列电流分别为0.088、0.074和0.051 μA，空白背景0.049 μA，可有效区分错配序列。六个独立制备电极检测1 pM miRNA-21的RSD为10.05%，重现性可接受。在人肝癌BEL-7402细胞和正常人肝L02细胞总RNA中，测得miRNA-21浓度分别为0.489和0.127 pM，相对误差分别为11.83%和12.98%，表明其可直接、无PCR扩增地分析细胞中差异表达的miRNA，具有用于低丰度肿瘤标志物快速检测的应用潜力。
传感器的构成
- 基底电极：玻璃碳电极（GCE），经抛光清洗，作为电化学换能基底
- 纳米修饰层：石墨烯纳米片（graphene），滴涂于GCE表面，提高导电性和有效表面积
- 纳米修饰层：树枝状金纳米结构（DenAu），电化学沉积于石墨烯/GCE上，增大表面积并锚定探针
- 排列/封闭剂：巯基丙酸（MPA），与探针共组装形成有序单分子层并减少非特异吸附
- 识别元件：巯基功能化LNA整合发夹分子信标探针（LNA-MB probe），5′-SH自组装固定，5′端识别miRNA-21，3′端结合报告DNA
- 信号放大元件：DNA–AuNPs–LNA生物条形码，AuNPs负载LNA报告DNA和生物素DNA，杂交后引入多个生物素
- 封闭剂：聚乙二醇3350（PEG-3350），封闭非特异性结合位点
- 酶标记物：链霉亲和素–辣根过氧化物酶（streptavidin–HRP），与生物素结合并催化底物反应
- 底物/电子供体：对苯二酚（hydroquinone）和H2O2，在HRP催化下生成对苯醌并产生还原电流
中文摘要
微小RNA（miRNA）是一类约22个核苷酸的内源性非编码RNA，其在多种实体瘤中异常表达，可能成为早期癌症诊断标志物。因此，无需标记和PCR扩增的miRNA检测方法具有重要意义。本文基于树枝状金纳米结构（DenAu）和石墨烯纳米片修饰的玻璃碳电极（GCE），构建了一种高灵敏、序列特异性的miRNA-21电化学生物传感器。巯基功能化的锁核酸（LNA）整合发夹分子信标（MB）探针作为捕获探针，与miRNA-21杂交后，茎环结构打开，其3′端与负载在AuNPs上的报告DNA杂交，引入AuNPs和生物素多功能生物条形码。随后，链霉亲和素–辣根过氧化物酶（streptavidin–HRP）通过生物素特异性结合到电极表面，催化H2O2氧化对苯二酚生成对苯醌，以对苯醌的电化学还原电流监测miRNA-21杂交事件。经实验条件优化，该传感器具有优异选择性和高灵敏度，检出限为0.06 pM，并成功用于人肝癌BEL-7402细胞和正常人肝L02细胞中miRNA-21表达分析。
英文摘要
MicroRNAs (miRNAs), a kind of small, endogenous, noncoding RNAs (∼22 nucleotides), might play a crucial role in early cancer diagnose due to its abnormal expression in many solid tumors. As a result, label-free and PCR-amplification-free assay for miRNAs is of great significance. In this work, a highly sensitive biosensor for sequence specific miRNA-21 detection without miRNA-21 labeling and enrichment was constructed based on the substrate electrode of dendritic gold nanostructure (DenAu) and graphene nanosheets modified glassy carbon electrode. Sulfydryl functionalized locked nucleic acid (LNA) integrated hairpin molecule beacon (MB) probe was used as miRNA-21 capture probe. After hybridized with miRNA-21 and reported DNA loading in gold nanoparticles (AuNPs) and biotin multi-functionalized bio bar codes, streptavidin-HRP was brought to the electrode through the specific interaction with biotin to catalyze the chemical oxidation of hydroquinone by H(2)O(2) to form benzoquinone. The electrochemical reduction signal of benzoquinone was utilized to monitor the miRNA-21 hybridization event. The effect of experimental variables on the amperometric response was investigated and optimized. Based on the specific confirmation of probe and signal amplification, the biosensor showed excellent selectivity and high sensitivity with low detection limit of 0.06 pM. Successful attempts are made in miRNA-21 expression analysis of human hepatocarcinoma BEL-7402 cells and normal human hepatic L02 cells.