组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
叶酸（folic acid, FA）、二氢叶酸（dihydrofolic acid, H2FA）、四氢叶酸（tetrahydrofolic acid, H4FA）、甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）、蝶呤（pterine, PT）、甲氧苄啶（trimethoprim, TMP）；样品基质为活KB细胞表面及无叶酸RPMI 1640培养液（含10% FBS）。
检测原理
LDAI试剂由甲氨蝶呤（MTX）亲和配体、酰基咪唑（AI）反应基团和荧光素（Fl）组成。MTX首先与内源性叶酸受体（FR）结合，使AI接近FR配体结合口袋附近的赖氨酸残基；随后AI与Lys的ε-氨基发生亲核酰基取代，形成氨基甲酸酯共价连接，同时释放MTX，得到保留配体结合能力的Fl-FR。当FA、H2FA、H4FA、MTX等配体结合FR时，结合口袋附近Fl的局部微环境改变，导致荧光强度增强（Imax/I0约1.2–1.7）。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）监测荧光时间曲线和浓度滴定，可分别获得结合速率常数kon和结合常数Ka。该过程利用配体导向近效应实现选择性标记，并以荧光变化作为配体结合的直接读出。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率、相关系数
效应效果
LDAI化学具有高选择性：在含DHFR、CAI、FKBP12、BSA、OVA和GST的蛋白混合物中，试剂1仅标记DHFR；MTX竞争抑制可完全阻断标记。对活KB细胞内源性FR，LDAI标记效率比LDT高12倍，2 h标记效率约17%，FA存在时标记显著降低。共价标记的FR经洗涤后仍可用SAv647检测，并可在FA刺激下监测内化。Fl-FR作为荧光生物传感器，FA 600 nM引起荧光增强，kon=3.0×10^4 M^-1 s^-1；多种配体Imax/I0为1.2–1.7，Ka顺序与已有方法一致。作者认为该方法可用于活细胞受体功能分析、药物靶点鉴定和筛选。
传感器的构成
- 基底/细胞膜：活KB细胞质膜（live KB cell membrane），作为内源性FR的天然载体与传感界面。
- 识别元件：内源性叶酸受体（folate receptor, FR），识别并结合叶酸类配体（FA、H2FA、H4FA、MTX等）。
- 亲和导向标记试剂：配体导向酰基咪唑试剂1（ligand-directed acyl imidazole, LDAI reagent 1），含甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）亲和配体、酰基咪唑（acyl imidazole, AI）反应基团和荧光素（fluorescein, Fl）探针。
- 信号标记物：荧光素（fluorescein, Fl），共价连接于FR结合口袋附近赖氨酸，作为荧光报告基团。
- 信号读出：共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM），监测Fl荧光强度随配体结合的变化。
中文摘要
基于化学的活细胞蛋白标记对于理解天然蛋白功能及生物制药应用具有重要意义。本文报道了一种用于体外和活细胞条件下内源性膜结合蛋白标记的新方法。作者设计了中等反应性的烷氧基酰基咪唑（AI）试剂，在配体结合亲和力辅助下实现配体导向酰基咪唑（LDAI）化学，从而选择性修饰天然蛋白，如二氢叶酸还原酶（DHFR）和叶酸受体（FR）；这些蛋白此前难以用配体导向甲苯磺酸酯方法高效标记。结果表明，LDAI可选择性标记DHFR中靠近配体结合口袋的单个赖氨酸（Lys32）。进一步将荧光素标记的内源性FR转化为活KB细胞表面的荧光生物传感器，实现了前所未有的原位配体结合动力学分析，为活细胞中天然受体蛋白的功能研究提供了新工具。
英文摘要
Chemistry-based protein labeling in living cells is undoubtedly useful for understanding natural protein functions and for biological/pharmaceutical applications. Here, we report a novel approach for endogenous membrane-bound protein labeling for both in vitro and live cell conditions. A moderately reactive alkyloxyacyl imidazole (AI) assisted by ligand-binding affinity (ligand-directed AI (LDAI)) chemistry allowed us to selectively modify natural proteins, such as dihydrofolate reductase (DHFR) and folate receptor (FR), neither of which could be efficiently labeled using the recently developed ligand-directed tosylate approach. It was clear that LDAI selectively labeled a single Lys(K32) in DHFR, proximal to the ligand-binding pocket. We also demonstrate that the fluorescein-labeled (endogenous, by LDAI) FR works as a fluorescent biosensor on the live KB cell surface, which allowed us to carry out unprecedented in situ kinetic analysis of ligand binding to FR.