组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
蛋白-蛋白相互作用（FKBP-FRB，体外重组蛋白缓冲液）、钙离子（Ca2+，HeLa活细胞胞内）、caspase-3活性（凋亡HeLa细胞）
检测原理
ddRFP-A1B1由含成熟发色团的A1与无发色团的B1组成。A1单独存在时发色团pKa约9.0，在生理pH下主要处于质子化非荧光态，量子产率仅0.026；B1无可见吸收和荧光。当被测事件使A1与B1结合时，如雷帕霉素桥接FRB-FKBP或Ca2+诱导CaM-M13结合，形成A1-B1异源二聚体。二聚化改变A1发色团微环境，使pKa降至7.4，平衡移向阴离子荧光态，量子产率升至0.074，红荧光增强约10倍。对于caspase-3，DEVD串联连接区被切割后A1与B1解离，红荧光降低。信号以红荧光强度变化读出，随结合/切割事件可逆或不可逆变化。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
ddRFP-A1B1的Kd约33 μM，使胞内浓度下主要解离；体外以剂量依赖方式响应雷帕霉素诱导的FKBP-FRB结合；在HeLa细胞中可逆成像Ca2+依赖的CaM-M13结合，动态范围为5.7±1.3（N=16），响应时间与FRET/单FP钙探针相当；在TNF-α诱导凋亡的HeLa细胞中，DEVD串联异源二聚体随caspase-3切割出现红荧光下降，动态范围为8.6±4.3（N=9），转变速率与FRET caspase-3探针相当。作者认为其可作为红色强度型、可逆基因编码生物传感器，补充FRET与FP互补策略；局限是pH敏感、A1残留约10%背景亮度。
传感器的构成
- 荧光换能层：A1（dTomato衍生单体RFP变体，含成熟发色团，单独存在时弱荧光，结合B1后红荧光增强）
- 荧光调节层：B1（dTomato衍生单体变体，无可见吸收/荧光，与A1形成低亲和力异源二聚体）
- 识别元件（体外）：FRB与FKBP（分别融合A1/B1，经雷帕霉素诱导结合，用于蛋白-蛋白相互作用检测）
- 识别元件（钙成像）：CaM与M13肽（A1-CaM与M13-B1，Ca2+诱导结合，用于活细胞钙信号成像）
- 识别元件（蛋白酶成像）：DEVD底物序列（位于A1-B1串联异源二聚体连接区，caspase-3切割后导致解离和荧光降低）
- 表达/展示平台：E. coli双表达质粒（Ptac/PBAD）或哺乳动物pcDNA3.1(+)质粒，用于表达融合蛋白
- 信号读出：荧光显微镜、微孔板读板仪或荧光光谱仪，检测红荧光强度变化
中文摘要
基于水母绿色荧光蛋白（GFP）变体的基因编码生物传感器已能成像多种细胞内生化过程，但红色荧光蛋白（RFP）基传感器仍较少。为便于在单细胞中同时成像多种生物传感器，作者开发了一种二聚化依赖型红色荧光蛋白（ddRFP）策略。通过理性工程与定向蛋白进化，获得由A1和B1组成的低亲和力异源二聚体，其解离常数Kd为33 μM，形成异源二聚体后荧光增强约10倍。A1含成熟发色团但单独存在时荧光弱，B1无可见吸收和荧光；二者结合后改变A1发色团微环境，使红荧光显著增强。作者进一步证明，ddRFP可用于体外检测蛋白-蛋白相互作用、活细胞中钙离子依赖的钙调蛋白与M13肽可逆结合成像，以及凋亡过程中caspase-3活性成像。
英文摘要
The expanding repertoire of genetically encoded biosensors constructed from variants of Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) enable the imaging of a variety of intracellular biochemical processes. To facilitate the imaging of multiple biosensors in a single cell, we undertook the development of a dimerization-dependent red fluorescent protein (ddRFP) that provides an alternative strategy for biosensor construction. An extensive process of rational engineering and directed protein evolution led to the discovery of a ddRFP with a K(d) of 33 μM and a 10-fold increase in fluorescence upon heterodimer formation. We demonstrate that the dimerization-dependent fluorescence of ddRFP can be used for detection of a protein-protein interaction in vitro, imaging of the reversible Ca²⁺-dependent association of calmodulin and M13 in live cells, and imaging of caspase-3 activity during apoptosis.