组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）；样品基质：人胰岛（human pancreatic islets）体外灌流液
检测原理
人胰岛在 KCl、低葡萄糖或 kainate 刺激下，由 α 细胞胞吐释放乙酰胆碱（ACh）。ACh 扩散至贴附的 CHO 生物传感器细胞表面，与稳定表达的 M3 毒蕈碱型 ACh 受体结合。M3 为 Gq 偶联受体，激活磷脂酶 Cβ2（PLCβ2）和肌醇三磷酸（IP3）通路，促使内质网 Ca2+ 释放，使胞内 Ca2+ 浓度升高。负载 Fura-2 的细胞中，Ca2+ 与探针结合后 340/380 发射比增加，倒置荧光显微镜以比值成像方式读出 Δ340/380。ACh 浓度越高，受体激活和 Ca2+ 响应越强，EC50 约 50 nM。阿托品阻断 M3 受体可消除响应，证明信号来自 ACh。
检测灵敏度
阈值浓度: 约 1–10 nM；EC50 ≈ 50 nM
效应效果
该细胞生物传感器在释放位点附近检测 ACh，阈值浓度约 1–10 nM，高于传统 ACh 电极（LOD 10 nM–0.1 mM）的灵敏度；EC50 约 50 nM。KCl 去极化不直接激活生物传感器，5 µM 阿托品可完全阻断 M3 受体介导的响应，说明选择性较好。作者报告检测 75 个人胰岛，其中 17 个出现 ACh 分泌信号；26 个小鼠胰岛均未检测到，差异显著（P < 0.01），同时 KCl 能诱导小鼠胰岛 Ca2+ 响应，提示其存活但未释放 ACh。方法信噪比高、重复性好，可跨样品、跨天和跨实验者重复，但主要为半定量，受受体脱敏、Ca2+ 耗竭和空间距离限制，不适合高通量。
传感器的构成
- 基底/样品室：Warner RC-25 灌流室与玻璃培养皿，承载人胰岛和生物传感器细胞
- 细胞维持层：Ham's F-12 培养基、FBS 和 Geneticin，维持 CHO 细胞及 M3 受体稳定表达
- 负载缓冲层：HHP 溶液（Hanks' buffered salt solution、HEPES、MEM Na pyruvate），用于 Fura-2AM 与 ATP 负载
- 识别元件：CHO K1 细胞稳定表达小鼠 M3 毒蕈碱型 ACh 受体（ATCC CRL-1981），特异性结合 ACh 并激活 Gq-IP3-PLC 通路
- 信号指示剂：Fura-2AM（Fura-2）Ca2+ 荧光探针，负载后通过 340/380 发射比报告胞内 Ca2+ 变化
- 贴附操作层：火抛光玻璃微吸管（borosilicate glass capillary）与液压操纵器，将单个生物传感器细胞贴附到人胰岛
- 样品基质：人胰岛（human pancreatic islets），在灌流室中接受 KCl、葡萄糖或 kainate 刺激并释放 ACh
- 光学换能/读出：倒置荧光显微镜（Olympus IX71）、氙灯（Lambda LS）和 EMCCD 相机（Andor iXon+），采集 Fura-2 340/380 比值
- 对照阻断剂：阿托品（atropine）阻断 M3 受体，用于确认信号由 ACh 介导；500 µM ATP 预孵育可脱敏内源 P2Y 受体
中文摘要
神经元、感觉细胞和内分泌细胞通过分泌神经递质和激素进行细胞间通讯，并协调器官与系统功能。要确认某物质是特定细胞使用的细胞外信号分子，必须直接证明其被分泌。本方案介绍利用生物传感器细胞实时检测内分泌细胞释放神经递质的方法。采用稳定表达毒蕈碱型乙酰胆碱受体 M3 的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为 ACh 生物传感器，负载 Ca2+ 指示剂 Fura-2，并用火抛光玻璃微吸管将其贴附于分离的人胰岛表面。通过改变葡萄糖浓度、KCl 去极化或海人酸等刺激胰岛，监测生物传感器细胞内 Ca2+ 荧光比值（340/380）变化；若 ACh 释放，M3 受体激活 Gq-IP3-PLC 通路引起胞内 Ca2+ 升高。阿托品可阻断该信号，证明响应由 ACh 介导。方法简单、灵敏、可实时、可拓展至多种受体/递质，整个成像检测约 3 h。
英文摘要
Neurons, sensory cells and endocrine cells secrete neurotransmitters and hormones to communicate with other cells and to coordinate organ and system function. Validation that a substance is used as an extracellular signaling molecule by a given cell requires a direct demonstration of its secretion. In this protocol we describe the use of biosensor cells to detect neurotransmitter release from endocrine cells in real-time. Chinese hamster ovary cells expressing the muscarinic acetylcholine (ACh) receptor M3 were used as ACh biosensors to record ACh release from human pancreatic islets. We show how ACh biosensors loaded with the Ca(2+) indicator Fura-2 and pressed against isolated human pancreatic islets allow the detection of ACh release. The biosensor approach is simple; the Ca(2+) signal generated in the biosensor cell reflects the presence (release) of a neurotransmitter. The technique is versatile because biosensor cells expressing a variety of receptors can be used in many applications. The protocol takes ∼3 h.