组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
L-甲硫氨酸（L-methionine, L-Met）、L-缬氨酸（L-valine, L-Val）、L-亮氨酸（L-leucine, L-Leu）、L-异亮氨酸（L-isoleucine, L-Ile）；样品基质为谷氨酸棒杆菌胞内氨基酸/发酵培养液（细胞悬液）
检测原理
该传感器利用谷氨酸棒杆菌天然转录调控因子 Lrp 作为识别元件。当胞内 L-Met、L-Leu、L-Ile 或 L-Val 浓度升高时，氨基酸与 Lrp 结合并改变其构象，使 Lrp 结合 lrp-brnF 间区中的 brnF 启动子（PbrnF），激活下游 eyfp 转录。eyfp 翻译并成熟后形成增强型黄色荧光蛋白 eYFP，在 510 nm 激发下产生 532 nm 发射荧光。荧光强度随胞内氨基酸浓度在低-中 mM 范围内近似线性增加，从而实现单细胞水平的模拟信号读出。二肽喂养通过竞争性摄取和胞内水解调节效应氨基酸浓度；FACS 或荧光显微镜读取单细胞 eYFP 信号，用于在线监测和高通量筛选。
检测灵敏度
LOD: 未报告；最小线性检测范围: L-Met 0.2–23.5 mM、L-Leu 0.2–13.6 mM、L-Ile 0.4–11.5 mM、L-Val 1.5–23.4 mM；最大诱导: 78-fold（L-Met）；最高胞内浓度: 25 mM；FACS 可区分 L-Met <1 mM 亚群。
效应效果
传感器对四种效应氨基酸有响应，对 Ala-Ala、Ala-Lys 和空载体无显著信号；Lrp 亲和力递增为 L-Val < L-Ile < L-Leu < L-Met。FACS 可区分胞内 L-Met 低于 1 mM 的亚群。DaceE 在线监测中 eYFP 与 L-Val 产量同步，生产开始 3 h 达峰值。微流控单细胞分析显示荧光、细胞大小和分裂间隔异质性，单细胞倍增时间 0.5–5 h。分选 1500 个细胞，正确率约 95%，存活率约 96%。S1 从约 600 万细胞分选 150 株，48 株中 23% 阳性；S2 高荧光亚群 25% 分泌显著 L-Val，存活率升至近 96%。Top 5 突变体 48 h 产 L-Val 最高 8.7 mM，L-Leu 最高 1.3 mM、L-Ile 最高 2.1 mM。
传感器的构成
- 宿主细胞/换能器：Corynebacterium glutamicum（谷氨酸棒杆菌）野生型或 DaceE 菌株，提供胞内代谢环境与基因表达系统
- 质粒载体：pJC1 穿梭质粒（KanR、oriVEc、oriVCg），携带传感器模块并在 E. coli 与 C. glutamicum 中复制
- 识别元件：Lrp（leucine-responsive protein，亮氨酸响应蛋白），结合胞内 L-Met、L-Leu、L-Ile、L-Val 并激活下游启动子
- 调控启动子：lrp-brnF 间区（含 brnF 启动子 PbrnF），响应 Lrp-氨基酸复合物并驱动报告基因转录
- 信号报告蛋白：eyfp（enhanced yellow fluorescent protein，增强型黄色荧光蛋白），表达后产生 510 nm 激发、532 nm 发射荧光
- 读出装置：荧光显微镜、JASCO FP-6500/6600 荧光分光光度计、BioLector 微孔板系统或 FACSAria II 流式细胞仪，检测 eYFP 荧光
中文摘要
单细菌细胞中特定代谢物的检测与定量是工业生物技术的重要目标。本研究开发了一种基于谷氨酸棒杆菌转录调控因子 Lrp 的全细胞生物传感器，用于检测胞内 L-甲硫氨酸（L-Met）及支链氨基酸 L-缬氨酸（L-Val）、L-亮氨酸（L-Leu）和 L-异亮氨酸（L-Ile）。该传感器将 lrp 基因、lrp-brnF 间区启动子与增强型黄色荧光蛋白 eyfp 融合，使胞内效应氨基酸浓度升高时驱动 eYFP 表达。实验表明，荧光输出与胞质氨基酸浓度呈线性关系；Lrp 对四种氨基酸的亲和力递增为 L-Val、L-Ile、L-Leu 和 L-Met。作者将该传感器用于在线监测丙酮酸脱氢酶缺陷型 C. glutamicum DaceE 菌株的 L-Val 生产，并分析单细胞水平细胞间变异。此外，该系统成功用于随机诱变后的高通量 FACS 筛选，分离出氨基酸生产突变体，展示了转录调控因子在微生物菌种分析、定向进化和高通量筛选中的应用价值。
英文摘要
The detection and quantification of specific metabolites in single bacterial cells is a major goal for industrial biotechnology. We have developed a biosensor based on the transcriptional regulator Lrp that detects intracellular l-methionine and branched-chain amino acids in Corynebacterium glutamicum. In assays, fluorescence output showed a linear relationship with cytoplasmic concentrations of the effector amino acids. In increasing order, the affinity of Lrp for the amino acids is l-valine, l-isoleucine, l-leucine and l-methionine. The sensor was applied for online monitoring and analysis of cell-to-cell variability of l-valine production by the pyruvate dehydrogenase-deficient C. glutamicum strain ΔaceE. Finally, the sensor system was successfully used in a high-throughput (HT) FACS screen for the isolation of amino acid-producing mutants after random mutagenesis of a non-producing wild type strain. These applications illustrate how one of nature's sensor devices - transcriptional regulators - can be used for the analysis, directed evolution and HT screening for microbial strain development.