组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞内环磷酸腺苷（cAMP）；功能检测对象：MC1R配体（α-MSH、NDP-α-MSH等）；样品基质：B16F10小鼠黑色素瘤细胞、HEK293细胞胞质。
检测原理
MC1R配体（如α-MSH、NDP-α-MSH）与细胞表面MC1R结合后，激活下游Gs蛋白/腺苷酸环化酶通路，使胞内cAMP浓度升高。BacMam病毒将Epac2-camps基因递送至细胞，表达由eCFP、Epac2B cAMP结合域和eYFP组成的单分子FRET蛋白。cAMP结合Epac2B域后引起构象变化，增大eCFP与eYFP间距，降低FRET效率，表现为eYFP发射下降、eCFP发射上升。检测时以427 nm激发，同时采集480 nm和530 nm发射，计算eYFP/eCFP比值（ΔRatio）。该比值随胞内cAMP浓度变化而改变，从而间接反映MC1R配体的激动/拮抗活性；BacMam的MOI和丁酸钠用于调节和增强传感器表达，提高信噪比。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该体系在B16F10和HEK293细胞中均可检测forskolin诱导的cAMP升高，pEC50分别为5.90±0.06和6.04±0.16，最大ΔRatio约10%–20%。MC1R配体pEC50：NDP-α-MSH 9.9±0.4、α-MSH 9.2±0.4、β-MSH 8.74±0.06、SHU-9119 8.9±0.3、MS-05 7.96±0.03、HS-024 7.27±0.13；I-THIQ无激活，10 nM JKC-363可阻断激活。EDTA去除二价离子后效价下降，1 mM Ca2+增强强于Mg2+。独立实验Z′因子>0.6，n=4。相比放射性cAMP积累法，该方法实时、无放射性、适合高通量筛选，但动态范围和灵敏度降低。
传感器的构成
- 细胞基底：B16F10小鼠黑色素瘤细胞或HEK293细胞，提供内源MC1R与胞内信号转导环境
- 基因递送层：BacMam杆状病毒载体pFastBac-Epac2-camps（CMV启动子），介导传感蛋白在哺乳动物细胞中表达
- 识别元件：Epac2-camps FRET蛋白（eCFP/eYFP-Epac2B cAMP结合域），特异性结合胞内cAMP
- 荧光标记层：增强型青色荧光蛋白eCFP与黄色荧光蛋白eYFP，构成FRET供体-受体对
- 离子/缓冲环境：DPBS缓冲液及1 mM Ca2+或Mg2+，维持MC1R激活与配体效价
- 表达增强剂：10 mM丁酸钠（sodium butyrate），抑制组蛋白去乙酰化以增强传感蛋白表达
- 信号读出：PHERAstar酶标仪，427 nm激发、480/530 nm双发射，计算eYFP/eCFP比值
中文摘要
环磷酸腺苷（cAMP）是多种G蛋白偶联受体（GPCR）的第二信使，也是评价GPCR特异性配体生物活性的有用读出分子。本文报道了一种基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器Epac2-camps，并将其与杆状病毒BacMam转导系统相结合。所构建的BacMam-Epac2-camps病毒转导系统可简便、稳健地在多种哺乳动物细胞系中表达cAMP传感器，用于第二信使水平的配体筛选；传感器蛋白表达量可依据病毒感染倍数（MOI）进行剂量依赖调节。作者以内源表达黑皮质素-1受体（MC1R）的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系建立检测体系，并用一组MC1R完全激动剂和部分激动剂表征受体激活。结果显示，二价离子Ca2+和Mg2+可调节配体效价，且效应具有配体和离子特异性。结果表明，BacMam-Epac2-camps系统也可用于研究其他GPCR的激活，并可应用于常规分析和高通量筛选。
英文摘要
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a second messenger of many G-protein-coupled receptors (GPCRs) and a useful readout molecule to estimate the biological activity of various GPCR-specific agents. Here we report the development and use of a Förster resonance energy transfer (FRET) biosensor for cAMP (Epac2-camps) combined with a baculovirus-based BacMam transduction system. The constructed BacMam-Epac2-camps viral transduction system is a simple and robust tool for ligand screening at the second-messenger level in a variety of mammalian cell lines. The level of biosensor protein expression can easily be adjusted in a dose-dependent manner depending on the multiplicity of viral infection. For setting up the assay, we used a B16F10 murine melanoma cell line with endogenous expression of melanocortin-1 receptor (MC(1)R). The receptor activation was characterized by a set of MC(1)R full and partial agonists. Bivalent ions Ca(2+) as well as Mg(2+) modulated ligand potencies, whereas the effect was ligand and ion specific. Results obtained for MC(1)R indicate that the BacMam-Epac2-camps system may also be applicable for studying the activation of other GPCRs and may be implemented in routine analysis as well as in high-throughput screening.