组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
克百威（carbofuran）、西维因（carbaryl）、甲基对氧磷（methylparaoxon）、敌敌畏（dichlorvos）；样品基质：含5%乙腈的PBS缓冲液及加标苹果皮乙腈提取液
检测原理
该传感器基于AChE抑制法。AChE催化底物ATChCl水解生成TCh，TCh在CoPC修饰的碳电极上于100 mV vs Ag/AgCl发生介导阳极氧化，产生与酶活性成正比的稳态电流。有机磷和氨基甲酸酯类农药与AChE结合后抑制其催化活性，使TCh生成减少，电流下降。检测时先在饱和底物（1 mmol L−1 ATChCl）下记录初始电流I1，再在含5%乙腈的PBS中孵育10 min后记录残余电流I2，相对抑制率%I=(I1-I2)/I1×100。由于底物饱和，信号变化主要反映酶-抑制剂相互作用，避免传质干扰。通过抑制率与农药对数浓度线性关系定量，无额外信号放大，灵敏度主要依赖基因工程AChE和CoPC低电位介导。
检测灵敏度
LOD（I10，5%乙腈-PBS）：B1酶——克百威 LOD: 4.5×10−9 mol L−1；线性范围: 4×10−9–8×10−8 mol L−1；斜率 b: 57±2；R^2 = 0.998；西维因 LOD: 1.6×10−7 mol L−1；线性范围: 9×10−8–4×10−6 mol L−1；斜率 b: 58±3；R^2 = 0.993；敌敌畏 LOD: 1.1×10−8 mol L−1；线性范围: 1×10−8–1×10−7 mol L−1；斜率 b: 74±39；R^2 = 0.996；甲基对氧磷 LOD: 4.4×10−8 mol L−1；线性范围: 2×10−9–4×10−6 mol L−1；斜率 b: 60±2；R^2 = 0.988。B394酶——克百威 LOD: 5.0×10−8 mol L−1；线性范围: 6×10−8–4×10−7 mol L−1；斜率 b: 59±5；R^2 = 0.990；西维因 LOD: 1.7×10−7 mol L−1；线性范围: 1×10−7–4×10−6 mol L−1；斜率 b: 54±3；R^2 = 0.990；敌敌畏 LOD: 9.6×10−11 mol L−1；线性范围: 2×10−10–1×10−8 mol L−1；斜率 b: 42±2；R^2 = 0.996；甲基对氧磷 LOD: 2.6×10−9 mol L−1（摘要报告为 2.7×10−9 mol L−1）；线性范围: 2×10−9–4×10−6 mol L−1；斜率 b: 52±2；R^2 = 0.977。电鳗酶——克百威 LOD: 3.8×10−8 mol L−1；线性范围: 8×10−8–1.5×10−7 mol L−1；斜率 b: 86±4；R^2 = 0.998；西维因 LOD: 1.6×10−7 mol L−1；线性范围: 1×10−7–5×10−6 mol L−1；斜率 b: 56±3；R^2 = 0.992；敌敌畏 LOD: 5.9×10−7 mol L−1；线性范围: 8×10−7–1.5×10−6 mol L−1；斜率 b: 35±5；R^2 = 0.963；甲基对氧磷 LOD: 5.3×10−7 mol L−1；线性范围: 5×10−7–2×10−6 mol L−1；斜率 b: 74±4；R^2 = 0.979。
效应效果
三种传感器固定重现性RSD为3.6%（B394）、4.1%（B1）、7.1%（电鳗）。连续12次注入1 mmol L−1 ATChCl，平均电流404±6、399±6、401±6 nA。4℃储存10 d RSD为2.3%、2.3%、2.9%；7个月后响应下降10%、10%、13%。5%乙腈孵育后残余活性与PBS无显著差异，10%和20%乙腈明显降低。加标苹果皮提取液结果与空白接近：克百威5.1×10−8对5.4×10−8、西维因4.2×10−7对4.5×10−7、甲基对氧磷1.6×10−8对1.8×10−8、敌敌畏2.3×10−9对2.6×10−9 mol L−1。方法较LC/GC快速、低成本，适合现场筛查。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：PVC支撑片上的丝网印刷电极（SPE），含银导电层、碳工作电极、Ag/AgCl参比电极、石墨辅助电极和绝缘层
- 工作电极修饰层：钴(II)酞菁（CoPC）修饰层，作为氧化还原介质，将硫代胆碱（TCh）氧化电位降至100 mV vs Ag/AgCl
- 识别元件：乙酰胆碱酯酶（AChE），包括电鳗AChE、果蝇野生型B1和基因工程B394，催化乙酰硫代胆碱（ATCh）水解
- 固定/保护层：光交联聚乙烯醇聚合物（PVA-AWP），以30%酶/70%PVA-AWP包埋AChE，经氖光交联固定
- 底物/信号前体：乙酰硫代胆碱氯化物（ATChCl），在酶催化下生成可电氧化的硫代胆碱（TCh）
- 信号换能层：TCh在CoPC介导下于碳工作电极阳极氧化，产生与酶活性成正比的安培电流
- 检测介质：0.1 mol L−1 PBS（pH 7，含0.1 mol L−1 KCl）加5%乙腈，用于农药孵育抑制和直接检测
中文摘要
本文报道了三种基于乙酰胆碱酯酶（AChE）的安培型生物传感器，用于在含5%乙腈的磷酸盐缓冲液中定量检测克百威、西维因、甲基对氧磷和敌敌畏。传感器分别采用电鳗AChE以及果蝇野生型（B1）和基因工程（B394）AChE，酶通过包埋于光交联聚乙烯醇聚合物（PVA-AWP）中固定在钴(II)酞菁（CoPC）修饰的丝网印刷电极上。四种农药均能抑制AChE活性，使底物乙酰硫代胆碱（ATCh）水解产生的硫代胆碱（TCh）氧化电流降低。各传感器表现出良好的操作稳定性、固定重现性和储存稳定性。最佳检出限分别为：B394酶检测敌敌畏和甲基对氧磷（9.6×10−11和2.7×10−9 mol L−1），B1酶检测克百威（4.5×10−9 mol L−1），B1酶和电鳗AChE检测西维因（1.6×10−7 mol L−1）。最后，传感器用于加标苹果样品中农药的直接检测。
英文摘要
Amperometric acetylcholinesterase biosensors have been developed for quantification of the pesticides carbofuran, carbaryl, methylparaoxon, and dichlorvos in phosphate buffer containing 5% acetonitrile. Three different biosensors were built using three different acetylcholinesterase (AChE) enzymes-AChE from electric eel, and genetically engineered (B394) and wild-type (B1) AChE from Drosophila melanogaster. Enzymes were immobilized on cobalt(II) phthalocyanine-modified electrodes by entrapment in a photocrosslinkable polymer (PVA-AWP). Each biosensor was tested against the four pesticides. Good operational stability, immobilisation reproducibility, and storage stability were obtained for each biosensor. The best detection limits were obtained with the B394 enzyme for dichlorvos and methylparaoxon (9.6 x 10(-11) and 2.7 x 10(-9) mol L(-1), respectively), the B1 enzyme for carbofuran (4.5 x 10(-9) mol L(-1)), and both the B1 enzyme and the AChE from electric eel for carbaryl (1.6 x 10(-7) mol L(-1)). Finally, the biosensors were used for the direct detection of the pesticides in spiked apple samples.