组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
膜型1基质金属蛋白酶活性（MT1-MMP activity），样品基质：活HT-1080细胞（细胞内/细胞膜周边）
检测原理
该传感器由mOrange2、MT1-MMP特异性底物和mCherry组成。完整状态下，532 nm光激发mOrange2后，能量通过FRET转移至mCherry，mOrange2荧光寿命缩短（约2 ns）；当MT1-MMP切割底物后，mOrange2与mCherry分离，FRET消失，mOrange2寿命延长（约3 ns）且其发射增强、mCherry发射降低。系统采用频域同相FLIM，用Pockels Cell调制激发光，检测相位和调制，通过极坐标图区分完整与切割两种寿命池；相位抑制用两幅相位图像相减，选择性显示某一构型。MT1-MMP活性越高，切割比例越高，长寿命/切割信号越强。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率；表1中极坐标图高斯拟合R^2=0.964、0.928、0.92、0.923、0.912、0.918。
效应效果
该传感器在活HT-1080细胞中可区分完整与切割两种构型：GM6001（20 μM，12–18 h）处理时主要呈完整态，极坐标坐标接近2 ns；未处理或洗脱GM6001约30 min后，细胞边缘出现切割态，寿命接近3 ns。相位抑制仅需两次曝光，单幅相位图像曝光约1–200 ms，完整FLIM通常采集8幅相位图像，作者称可缩短至小于1秒，适合动态监测。相位抑制图像与极坐标图分数强度一致，说明选择性良好。相比简单FRET比值法，FLIM可定量区分构型且无需强度校正，长波长还降低自荧光和光损伤，适用于活细胞MT1-MMP时空活性成像。
传感器的构成
- 细胞基底：HT-1080细胞（HT-1080 cells），内源表达MT1-MMP，提供活细胞检测环境
- 识别元件：MT1-MMP特异性底物（MT1-MMP-specific substrate），被MT1-MMP切割以改变FRET状态
- 供体荧光蛋白：mOrange2（mOrange2），作为FRET供体，切割后荧光寿命延长
- 受体荧光蛋白：mCherry（mCherry），作为FRET受体，与mOrange2形成红移FRET对
- 融合传感器：mOrange2/mCherry MT1-MMP biosensor，整合底物与荧光蛋白并转染进入细胞
- 抑制剂对照：GM6001（GM6001），MMP抑制剂，阻止底物切割并用于洗脱后动态观察
- 光学换能/读出：频域同相FLIM系统（frequency-domain homodyne FLIM），532 nm激光、Pockels Cell、intensifier、CCD camera与560–640 nm滤光片，读取相位/调制
中文摘要
膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）是一种膜锚定胶原酶，主要参与细胞外基质蛋白的机械降解，并在多种癌症中上调，其迁移与侵袭中的协调功能仍不清楚。本文利用一种特异性识别MT1-MMP的细胞内Förster共振能量转移（FRET）生物传感器，对侵袭性HT-1080活细胞进行成像。该传感器由MT1-MMP特异性底物与mOrange2和mCherry红移荧光蛋白融合构成。作者采用荧光寿命成像显微镜（FLIM）确定传感器构型，并结合极坐标图分析和一种快速FLIM数据采集模式——相位抑制（phase suppression）。结果显示，传感器被MT1-MMP切割前后的两种构型可在同一细胞内清晰分辨；去除MMP抑制剂GM6001后，传感器构型变化主要出现在细胞边缘。相位抑制图像中高亮的强度与极坐标图得到的分数强度良好相关，表明该方法可快速、定量地监测活细胞中MT1-MMP的时空活性。
英文摘要
Membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) is a membrane-tethered collagenase primarily involved in the mechanical destruction of extracellular matrix proteins. MT1-MMP has also been shown to be upregulated in several types of cancers. Many coordinated functions of MT1-MMP during migration and invasion remain to be determined. In this paper, live cells from the invasive cell line HT-1080 were imaged using an intracellular Förster resonance energy transfer-based biosensor specific for MT1-MMP; a substrate specific for MT1-MMP was hybridized with the mOrange2 and mCherry fluorescent proteins to form the Förster resonance energy transfer-based sensor. The configuration of the biosensor was determined with fluorescence lifetime-resolved imaging microscopy using both a polar plot-based analysis and a rapid data acquisition modality of fluorescence lifetime-resolved imaging microscopy known as phase suppression. Both configurations of the biosensor (with or without cleavage by MT1-MMP) were clearly resolvable in the same cell. Changes in the configuration of the MT1-MMP biosensor were observed primarily along the edge of the cell following the removal of the MMP inhibitor GM6001. The intensities highlighted by phase suppression correlated well with the fractional intensities derived from the polar plot.