组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
PhIP（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine）及其 CYP1A2/NAT 代谢生成的反应性代谢物；样品基质为 pH 7.5 缓冲液反应体系（含 H2O2、AcCoA、DTT、EDTA）
检测原理
传感器以热解石墨为工作电极，LbL 薄膜中 CYP1A2 和 NAT 构成顺序代谢途径。PhIP 进入薄膜后，CYP1A2 在 H2O2 存在下催化 N-羟基化生成 N-OH-PhIP；NAT 在 AcCoA 存在下进一步 O-乙酰化生成 N-乙酰氧基-PhIP。两种代谢物均可分解为亲电亚硝鎓离子，与 DNA 鸟嘌呤共价结合形成加合物。加合物使双链 DNA 局部破坏，鸟嘌呤更易接近 Ru(bpy)3^2+ 或 RuPVP。电极将 Ru(II) 氧化为 Ru(III)，Ru(III) 氧化鸟嘌呤后再生 Ru(II)，形成催化循环；方波伏安峰电流随加合物数量增加而增大。双酶途径比单酶更快产生高反应性 N-乙酰氧基-PhIP，从而放大 DNA 损伤信号。
检测灵敏度
峰比初始斜率: 0.60 min^-1（CYP1A2/NAT/DNA）；0.20 min^-1（CYP1A2/DNA）
效应效果
选择性方面，肌红蛋白 Mb/DNA 对照和 NAT/DNA 对照均未出现显著峰电流增加，说明信号来自 CYP1A2/NAT 双酶代谢途径；3–5 次对照试验的相对标准偏差约 8%。双酶传感器 DNA/RuPVP/DNA/(CYP1A2/DNA)2/(NAT/DNA)2 的损伤峰比初始斜率为 0.60 min^-1，明显高于仅含 CYP1A2 的 0.20 min^-1。QCM 测得 60 nm 双酶膜含 0.16 mmol cm^-3 DNA 和 20 mmol cm^-3 CYP1A2，44 nm 单酶膜含 0.15 mmol cm^-3 DNA 和 28 mmol cm^-3 CYP1A2，表明双酶膜中 CYP1A2 浓度并不更高，排除单酶氧化单独解释。作者认为该多酶膜可用于反应性代谢物毒性筛选阵列。
传感器的构成
- 基底电极：热解石墨（PG）盘，作为导电基底与电化学换能界面
- 组装/信号层：钌金属聚合物（RuPVP，[Ru(bpy)2(PVP)10]^2+）与 DNA 交替层，通过 LbL 静电吸附固定酶并提供催化氧化鸟嘌呤的钌中心
- 反应靶标层：双链 DNA（ds-DNA），作为代谢产物反应位点，形成加合物后改变催化伏安响应
- 代谢酶层1：细胞色素 P450 1A2（CYP1A2），催化 PhIP 的 N-羟基化生成 N-OH-PhIP
- 代谢酶层2：N-乙酰转移酶（NAT），催化 N-OH-PhIP 的 O-乙酰化生成 N-乙酰氧基-PhIP
- 可溶性催化剂：三(2,2'-联吡啶)钌(II)（Ru(bpy)3^2+），用于单酶对照的催化伏安检测
中文摘要
本文首次报道一种具有顺序双酶代谢途径的电化学生物传感器，用于筛选芳香胺代谢过程中产生的潜在毒性反应性代谢物。作者采用层层静电吸附法，在热解石墨电极上组装 DNA、细胞色素 P450 1A2（CYP1A2）和 N-乙酰转移酶（NAT）纳米薄膜。以 PhIP 为模型底物，CYP1A2 催化其 N-羟基化生成 N-OH-PhIP，NAT 进一步催化 O-乙酰化生成 N-乙酰氧基-PhIP；两者均可分解为亚硝鎓离子，并与 DNA 鸟嘌呤形成加合物。方波伏安法通过 Ru(bpy)3^2+ 或 RuPVP 催化氧化鸟嘌呤检测 DNA 损伤：DNA 加合物使双链局部破坏，鸟嘌呤更易接近催化剂，催化峰电流增大。结果显示双酶传感器的损伤速率高于单酶传感器，对照无显著变化，证明该传感器可用于体外毒性筛选。
英文摘要
We demonstrate for the first time a biosensor featuring a sequential two-enzyme pathway suitable to screen potentially toxic reactive metabolites generated during metabolism.