组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
亚硫酸盐（sulfite）；样品基质：红葡萄酒、白葡萄酒（稀释样品）
检测原理
亚硫酸盐进入多层膜后，被固定的人源亚硫酸盐氧化酶（SO）催化氧化为硫酸盐，反应中SO的钼辅因子（Moco）接受电子，并经细胞色素b5血红素域传递给邻近细胞色素c（cyt c）。被还原的cyt c通过多层中cyt c–cyt c相互作用和PASA介导的电子交换，将电子传递至底层cyt c单分子层，再经MUA/MU修饰金电极发生直接电子转移而再氧化。恒电位仪在+0.1 V（vs. Ag/AgCl, 1 M KCl）下记录催化氧化电流。亚硫酸盐浓度越高，SO催化还原cyt c的速率越快，稳态电流越大；在1–60 µM范围内电流与浓度呈线性关系。低工作电位避免了过氧化氢检测中的高电位干扰，PASA/cyt c多层结构提供电子传递通道并增加酶负载，实现无试剂电催化放大。
检测灵敏度
LOD: 1 µM；线性范围: 1–60 µM；灵敏度: 2.19 mA M−1；r = 0.98（正文）/0.99（图3）
效应效果
该传感器在低工作电位下运行，显著降低葡萄酒中抗氧化物质等干扰。白葡萄酒未加标时未检测到非特异信号，加标回收率为97%–101%；红葡萄酒部分样品出现8%–33%非特异信号，回收率48%–102%，作者认为目前仅适用于白葡萄酒。经PASA/PAA覆盖层和40°C热处理后，电极连续工作3天稳定，5天后灵敏度损失约20%，8次重复测量误差3.8%；干燥储存超过10周仍保持活性。与过氧化氢检测相比，低电位提高选择性并减少电极污染。作者认为该体系可通过调节层数改变灵敏度，适用于食品与饮料中亚硫酸盐的低干扰测定。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金线电极（Au wire, 0.5 mm），作为工作电极与电子传递界面。
- 自组装单分子层：11-巯基-1-十一烷酸（MUA）与11-巯基-1-十一烷醇（MU）混合自组装层（5 mM MUA/5 mM MU, 1:3 v/v），提供负电荷表面并固定细胞色素c。
- 细胞色素c单分子层：马心脏细胞色素c（cyt c, 20 µM, buffer 3 pH 8.5）静电吸附，作为电子介体并与金电极发生直接电子转移。
- 聚电解质间隔层：磺化聚苯胺（PASA, 0.2 mg/mL, buffer 1 pH 5）逐层吸附，作为静电胶黏剂并促进电子交换。
- 酶/介体共固定层：人源亚硫酸盐氧化酶（SO, 1 µM）与细胞色素c（cyt c, 20 µM）在buffer 2 pH 7中共同吸附，形成催化识别与电子传递网络。
- 保护覆盖层：额外PASA层和聚烯丙基胺盐酸盐（PAA, 0.2 mg/mL）覆盖，减少蛋白泄漏并提高稳定性。
- 热处理稳定化层：40°C buffer 1处理30 min，使多层结构重组致密化，提高蛋白-聚电解质接触和稳定性。
中文摘要
本文报道了一种用于亚硫酸盐检测的高效电催化生物传感器。该传感器通过逐层组装技术，将人源亚硫酸盐氧化酶（SO）与细胞色素c（cyt c）在含磺化聚苯胺（PASA）的多层结构中共同固定于金电极表面。石英晶体微天平（QCM）、紫外-可见光谱和循环伏安法表明，随着双层层数增加，电化学活性蛋白负载量线性增加。传感器在低工作电位下无试剂运行；在+0.1 V（vs. Ag/AgCl, 1 M KCl）极化下，修饰金电极在亚硫酸盐存在时产生催化氧化电流。通过增加SO/cyt c层数可提高灵敏度，17双层层电极对亚硫酸盐的线性范围为1–60 µM，灵敏度为2.19 mA M−1，响应时间约2 min。经聚电解质覆盖层和热处理稳定化后，电极可稳定工作3天，连续测量重现性为3.8%，5天后灵敏度损失约20%，干燥储存可超过2个月。该传感器用于红葡萄酒和白葡萄酒中未加标及加标亚硫酸盐的测定，并评估了回收率与信号特异性。
英文摘要
An efficient electrocatalytic biosensor for sulfite detection was developed by co-immobilizing sulfite oxidase and cytochrome c with polyaniline sulfonic acid in a layer-by-layer assembly. QCM, UV-Vis spectroscopy and cyclic voltammetry revealed increasing loading of electrochemically active protein with the formation of multilayers. The sensor operates reagentless at low working potential. A catalytic oxidation current was detected in the presence of sulfite at the modified gold electrode, polarized at +0.1 V (vs. Ag/AgCl 1 M KCl). The stability of the biosensor performance was characterized and optimized. A 17-bilayer electrode has a linear range between 1 and 60 microM sulfite with a sensitivity of 2.19 mA M(-1) sulfite and a response time of 2 min. The electrode retained a stable response for 3 days with a serial reproducibility of 3.8% and lost 20% of sensitivity after 5 days of operation. It is possible to store the sensor in a dry state for more than 2 months. The multilayer electrode was used for determination of sulfite in unspiked and spiked samples of red and white wine. The recovery and the specificity of the signals were evaluated for each sample.